Dieses Protokoll demonstriert eine verbesserte Methode zur Beschaffung menschlicher Zahnepithelzellen. Es ist schwierig, das aggregierte Zellpellet während der Verfahren zu identifizieren. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit Überständen umgehen, um den Verlust von Zellpopulationen zu verhindern.
Um zu beginnen, ernten Sie Zahnfollikel während der chirurgischen Extraktion von betroffenen dritten Molaren. Beginnen Sie mit der Zellisolierung oder lagern Sie die Zahnfollikel bei vier Grad Celsius in DPBS mit 3% Penicillin-Streptomycin. Um die Zahnfollikel zu waschen, halten Sie den Zahnfollikel mit einer Pinzette fest und legen Sie ihn in das Waschrohr 1.
Schütteln Sie es vorsichtig 10 bis 15 Mal. Nehmen Sie es heraus und legen Sie es in Röhre 2. Schütteln Sie es erneut 10 bis 15 Mal.
Nehmen Sie es schließlich heraus und legen Sie es in Röhre 3, dann schütteln Sie es. Nachdem Sie den Zahnfollikel dreimal gewaschen haben, legen Sie ihn in eine 60-Millimeter-Kulturschale. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Gewebeschere, bis der Zahnfollikel ein breiiges oder matschiges Aussehen hat.
Verwenden Sie einen kleinen Seitenbereich der Kulturschale, um den Gewebeverlust zu minimieren. Mischen Sie je einen Milliliter Kollagenase Typ 1 und Proteaselösung in einem 15 Milliliter konischen Röhrchen. Das gehackte Gewebe in das konische 15-Milliliter-Röhrchen geben, dann vorsichtig schütteln und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Fügen Sie fünf Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in die Tube hinzu. Schütteln Sie es und inkubieren Sie es für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Herstellung eines Keratinozytenmediums, das keratinozytenserumfreies Medium und 10 % fötales Rinderserum enthält.
Fügen Sie drei Milliliter Keratinozytenmedium in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen hinzu. Legen Sie ein 40-Mikrometer-Sieb auf dieses Rohr. Als nächstes saugen Sie den Überstand aus dem Röhrchen, das das Gewebe enthält, mit einer 10 Milliliter serologischen Pipette ab und führen Sie ihn durch das Sieb.
Die gesammelte Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Rohr geben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Überstand. Dann fügen Sie drei Milliliter keratinozyten serumfreies Medium hinzu.
Weitere drei Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen. Die einzelne Zellpopulation wird mit dem serumfreien Keratinozytenmedium in eine 60-Millimeter-Kulturschale gekeltert. Bewahren Sie die Kulturschale mit einem Endvolumen von fünf Millilitern in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius auf.
Zellen mit epithelialer Morphologie erschienen innerhalb von sieben bis 10 Tagen nach der Plattierung einzelner Zellpopulationen. Die Anzahl der kopfsteingepflasterten Epithelzellen reichte zum Zeitpunkt des Auftauchens von eins bis 10 und die Zellen dehnten sich im Laufe der Zeit zu Kolonien aus. Der wichtigste Schritt ist das Zerkleinern des Zahnfollikels in kleine Partikel.
Es verbessert die Trennung einzelner Zellen vom Follikelgewebe. Mesenchymale Zellen können aus menschlichen Zahnfollikeln isoliert werden. Serumhaltige Kulturumgebung wählt mesenchymale Zellen aus und hemmt das Epithelwachstum aus Einzelzellpopulationen.
Dieses Protokoll bietet die Methode zur Beschaffung der menschlichen Zahnepithelzellen. Dentalfollikel-abgeleitete Epithelzellen können für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Interaktionen verwendet werden.
