This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. Zell Plating und Transfektion <ol><li> In einer Zellkultur Kapuze, Platte ~ 300.000 bis ~ 500.000 SN56-Zellen (ein freundliches Geschenk von Dr. Jane Rylett) auf einer 35 mm Glasboden konfokalen Teller geben und mit vorge Transfektionsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, DMEM, ergänzt mit 10% FBS). </li><li> Zellen beimpft und über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator zu vermehren. Hinweis: Die Zellen sollten ca. 50% -70% konfluent vor der Transfektion werden. </li><li> In einem Zellkulturhaube, transfizierenden Zellen mit Plasmiden, ein fluoreszierendes Protein exprimieren, markiert TGN Markierung (Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein gekoppelt ist, GalT-GFP), ein fluoreszierendes Protein markiert Fach Marker (hier Lysosom assoziiertes Membranprotein 1, LAMP1, getaggt mRFP) und das Protein von Interesse mit paGFP (&amp; beta; APP-paGFP markiert). (Diese Konstrukte sind zuvor beschrieben worden, 30) </li><li> Zellen mit Transfektionsreagenz und Plasmid-DNA f inkubierenoder 24 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Verwenden Sie ein Verhältnis von ~ 2 ug DNA zu 5 ul Transfektionsagens (zB Lipofectamin 2000), um ein optimales Gleichgewicht Zytotoxizität und Transfektionseffizienz. Tatsächlichen Konzentrationen eventuell auf unterschiedlichen Plasmiden optimiert werden. In den hier beschriebenen Experimenten verwenden 1 ug / konfokalen Gericht von &amp; bgr; APP-paGFP, 0,3 ug / konfokalen Gericht aus LAMP1-mRFP und 0,2 ug / konfokalen Gericht aus GalT-GFP. Anmerkung: Die Menge des verwendeten Plasmids wird auf die Transfektionseffizienz abhängen. </li><li> Für neuronale Zellinien: Nach dem Schritt 1.4, in einem Zellkulturhaube Entfernen vorge Transfektionsmedium und Differenzierung SN56-Zellen in 2 ml DMEM mit 0,1% Penicillin / Streptomycin, ergänzt mit 1 mM Dibutyryl-cyclisches AMP (dbcAMP) für 24 Std. </li></ol> 2. Mikroskop Bühne Vorbereitung <ol><li> Vorwärmen phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) bis 37 ° C. Warm-up vor dem Mikroskoptisch Imaging bis 37 ° C. </li><li> Wash Zellen zweimal mit PBS, um die Differenzierung Medien entfernen und ersetzen Sie mit 2 ml HBSS bei 37 ° C. Ortszellen am Mikroskoptisch erwärmt auf 37 ° C. Hinweis: Zellen lebensfähig für ca. 1,5 bis 2 h in HBSS sind. </li><li> Lassen Sie 5-10 Minuten für die konfokale Plattentemperatur mit dem Mikroskoptisch ins Gleichgewicht. </li></ol> 3. Foto-Aktivierung von ROIs über den Golgi <ol><li> Mit dem Mikroskop-Okular, finden Sie Zellen mit GalT-CFP, LAMP1-mRFP und &amp; bgr; APP-paGFP transfiziert. <ol><li> Verwenden Sie eine Öl-Immersionslinse mit hoher Vergrößerung (dh 63X oder 100X). Zur optischen Konformation der Fluoreszenz, verwenden Sie einen Filter zu setzen in der Lage ist die Visualisierung FITC (für GFP und GFP-Fluoreszenz) und Rhodamin (für mRFP Fluoreszenz). </li></ol></li><li> Stellen Sie die konfokale Scheibe für jeden Kanal bis 1 um. Nehmen Sie ein Bild mit niedriger Auflösung. </li><li> Crop für Bild nur die Zelle von Interesse. </li><li> Verwenden Sie den Einstellknopf, manuell eingestelltdie Brennebene zu der Mitte der Zelle. Dies ist typischerweise der Teil der Zelle, wo der Kern der größte ist. </li><li> Draw 3-5 kreisförmige Regionen of Interest (ROIs) innerhalb des TGN (GalT-GFP-Fluoreszenz). <ol><li> So zeichnen ROIs (dh in der Zeiss LSM-Programm), wählen Sie &quot;Bearbeiten ROI &#39;Schaltfläche in der Befehlskonsole. </li><li> Wählen Sie das kreisförmige ROI-Taste. </li><li> Klicken und ziehen Sie über GalT-GFP positive Regionen der Zelle. Hinweis: Die Photobleaching-Pakete für viele Mikroskope haben diese Fähigkeit. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Bild von der Zelle mit dem überlagerten ROIs. Speichern Sie eine Kopie der ROIs zur späteren Referenz. <ol><li> Um die ROIs auf das Bild zu speichern, wählen Sie den &quot;Makro&quot; -Taste. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Laden&quot;, um die &quot;CopyRoisToOverlay&quot; (Dateipfad: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb) starten. Hinweis: ein konfokales Mikroskop mit 475 bis 525 nm (GFP) Bandpass (BP), eine 500 bis 530 nm BP (GFP) ausgestattet,und ein 560 nm langen Pass (LP) Filtersätze sind erforderlich. Ein Argon-Laser für 458 nm und 488 nm Emission und einem HeNe-Laser für 540 nm-Emission ist ebenfalls erforderlich. </li></ol></li><li> Set-up des Mikroskops für eine Bleichzeitverlauf. <ol><li> Stellen Sie die Laserdiode (25 mW 405 nm Laser), um maximale Leistung. Vorsicht: Übermäßiger Photoaktivierung könnte zu produzieren Foto-Toxizität oder Schäden an Zellmembranen führen. Augenschutz benutzen, um Netzhautschäden zu vermeiden. </li><li> Set-up das Mikroskop für 120 Zyklen der Bildgebung. Hinweis: eine Abbildungszyklus besteht aus Bleich innerhalb der ROIs und Bilderzeugung der gesamten Zelle. Dies ist ein Bleichzeitverlauf. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop zu bleichen (Foto deaktivieren) nur die ROIs für 20-30 Iterationen nach jedem Bild. Die Zeit, um das Bild und Bleichmittel ein Bild variieren. Festlegen einer Zeitverzögerung zwischen den Bildern, so dass jeder Zyklus etwa 30 Sekunden. Hinweis: Der Abbildungsteil jedes Zyklus dauert etwa 15-30 sec, je nach Größe des Bildes. Die Bleich für jedes ROI ist etwa 50 msec. Bleich aller 4 ROIs 20 Iterationen 4 Sekunden am Ende jedes Bleichmittel / Bildzyklus zu nehmen. </li></ol></li><li> Starten Sie das Bleichzeitverlauf. </li><li> Ausschalten des Bleich nach 15 min (30 Zyklen von Bildgebung und Bleichen), sondern weiterhin die Aufnahme von Bildern der Zelle. Hinweis: Zeit 0 bis 15 min ist der &quot;Puls&quot; Periode. </li><li> Weitere Bilder aufzunehmen für 45 min (ohne Bleichen), um den Abstand von &amp; bgr; APP-paGFP folgen. Hinweis: Zeit 15 bis 45 Minuten ist die &quot;Jagd&quot; Periode. </li><li> Unter Verwendung der in Schritt 6 beschriebenen Analyseverfahren, Co-Lokalisation des Proteins von Interesse (hier ßAPP-paGFP) mit dem Fach von Interesse (hier LAMP1-mRFP), indem sie Flächen für jeden Kanal. </li></ol> 4. Bestimmen Sie die Downstream-Compartments <ol><li> Um festzustellen, ob Lysosomen (in diesen Experimenten) sind die letzte Kammer, fügen membranpermeablen Protease-Inhibitoren, um zu bewirken Proteine ​​im Lysosom anreichern.<ol><li> Für ßAPP, verwenden Sie 0,5 um L685, 458 (spezifische γ-Sekretase-Hemmer) über Nacht oder 100 uM Chloroquin (entsäuert Lysosomen) 30 Minuten vor der Bildgebung. </li></ol></li><li> Finden Zellen und photoaktivieren, wie in Schritt 3,1 bis 3,8. </li><li> Bild die Zelle für ein zusätzliches 45-min (ohne Photoaktivierung) zu bestimmen, wo &amp; beta; APP-paGFP sammelt sich in Abwesenheit von Spaltung. </li><li> Analysieren die Lieferung von Protein zu Lysosomen (oder andere stromab gelegene Abteil) und anschließender Abstand entsprechend dem in Schritt 6 beschriebenen Verfahren. </li></ol> 5. Stellen Sie sicher Genauigkeit der Photoaktivierung im Golgi <ol><li> Aufwärm HBSS auf 37 ° C. </li><li> Bereiten eine 2 ml Lösung zu jedem konfokalen Platte abgebildet werden, von 66 &amp; mgr; M Nocodazol (Behandlung) oder DMSO (Kontrolle) in HBSS. <ol><li> Zum einen konfokalen Platte, Pipette 2 ml 37 ° C HBSS und fügen 7,96 ul Nocodazol aus einem 16,60 mM Nocodazol Lager. </li><li> Als Kontrolle solution, Pipette 2 ml 37 ° C HBSS in ein 2-ml-Tube und füge 7,96 ul DMSO. </li></ol></li><li> Zellen in HBSS mit Nocodazol oder DMSO Inkubation für 5 min vor der Bildgebung. </li><li> Finden Zellen wie in Schritt 3.1. </li><li> Vor der Photoaktivierung, bereiten Sie das Mikroskop, um eine Z-Stapel nach der Photoaktivierung Zeitraum. <ol><li> Klicken Sie auf das &quot;Z-Stapel&quot; Taste. Starten Sie das Scannen unter Verwendung der schnellen XY. </li><li> Stellen Sie die Brennebene mit dem Mikroskop Einstellknopf an die Spitze der Zelle. Drücken Sie &#39;Mark First&#39;, um die erste Position in dem Stapel gesetzt. </li><li> Einstellen der Brennebene der Mikroskop Einstellknopf am Boden (in der Nähe des Glases) der Zelle. Drücken Sie &#39;Mark Last&#39;, um die letzte Position im Stapel gesetzt. </li><li> In der Stapeltafel Z, drücken Sie die &quot;Z Schneiden &#39;button. Stellen Sie die &quot;Intervall&quot; bis 1 um. Hinweis: Für eine höhere räumliche Auflösung Stapel einen kleineren Stack Intervall, aber mehr Bilder werden zu müssen,Verlängerung der Frist für die Bildgebung des Stapels genommen werden. </li></ol></li><li> Bleichen der Zellen, wie in Schritt 3,7-3,8 beschrieben. Foto-activate und Bild von 0 min bis 15 min (30 Bilder). </li><li> Stoppen Bildgebung nach 30 Bildern. Ein Bild des Videos sofort zu speichern. Achtung: Einige Mikroskope können erste Video zu überschreiben, wenn es nicht vor dem Start eines zweiten Bildsequenz gespeichert. </li><li> Nach dem Speichern des Videos sofort erwerben ein Z-Stack, mit den Parametern von Schritt 5.5. </li><li> Kolokalisieren ßAPP-paGFP mit GalT-GFP (oder andere Golgi-Marker), wie in Schritt 6 beschrieben. Hinweis: CFP Photobleichmittel schneller und möglicherweise nicht sichtbar durch das Ende des bildgebenden Zeitraum. Kolokalisation nicht möglich mit GalT-GFP sein. Wenn Kolokalisation benötigt wird, verwenden, um mRFP GalT taggen. </li></ol> 6. Vesicle Filtern und Kolokalisation <ol><li> Verwenden Sie ein Analyseprogramm (zB Imaris) auf Oberflächen von dem Fach (zB LAMP1-mRFP) und ein Protein o machenf Interesse (zB &amp; bgr; APP-paGFP). </li><li> Geben Sie im Abschnitt &quot;Surpass&quot; des Analyse-Programm, indem Sie auf die Schaltfläche Übertreffen auf der oberen Menüleiste. </li><li> Wählen Sie die Fläche Assistenten Taste an der Oberseite des äußersten linken Panel (5. Taste von links). </li><li> Wählen Sie einen Kanal, um Vesikel (dh &amp; bgr; APP-paGFP Fluoreszenz Protein von Interesse) filtern. </li><li> Führen Hintergrundsubtraktion durch Vorlage des Durchmessers der größten Vesikel in das Feld mit dem Assistenten ein und klicken Sie auf Weiter. Das Analyseprogramm wählt automatisch - basierend auf einem Schwellenwert von der größten Vesikel im Bereich abgeleitet - ein Bereich, in dem interessierenden Kanal. <ol><li> Manuelle Einstellung der Schwelle Hintergrund, um die Auswahl zu verfeinern, wenn nötig. </li></ol></li><li> An der Unterseite des Threshold-Auswahlbildschirm, überprüfen Option &#39;Split berührende Objekte&#39;, um den kombinierten Oberflächen zu trennen. Hinweis: Wenn viele Vesikel sind eng gruppiertzusammen, die Analyse-Programm-Gruppe diese Objekte unter einer Oberfläche. <ol><li> Wählen 10-15 repräsentativen Vesikel und die Berechnung der durchschnittliche Vesikeldurchmesser und geben Sie das Ergebnis in den Assistenten. </li></ol></li><li> Verfeinern Sie die ausgewählten Saatpunkte durch Erhöhen oder Verringern der Schwelle auf &quot;Qualität&quot; (Intensität des Kanals in der Mitte jeder Ort). Hinweis: Die Oberflächen des Kanals von Interesse erzeugt. Eine weitere Verfeinerung der ausgewählten Flächen kann an dieser Stelle durchgeführt werden. Schwelle Vesikel auf Basis der Anzahl der Pixel in jedem Vesikel. </li><li> Maske der ursprünglichen Kanal mit dieser Oberfläche. Zu maskieren, wählen Sie die Registerkarte 4. von links in der Oberflächenerstellungsassistenten (Bleistift). </li><li> Wählen Sie &#39;Mask All&#39;. Ein neuer Kanal mit den Vesikeln von Interesse erzeugt. Hinweis: Während des Maskenprozess, ist eine Option, um den ursprünglichen Kanal zu duplizieren angeboten. Wählen Sie diese Option, wenn die Originaldaten gespeichert werden muss. </li><li> Wiederholungen sTEPs 6.1 bis 6.7 für das ungefilterte Kanal (dh LAMP1 mRFP, Fach). </li><li> An der oberen Werkzeugleiste, wählen Sie die Kolokalisation Werkzeug. <ol><li> In der oberen Platte, wie die Histogramme der Kanäle zu kolokalisiert zu sein scheinen, wählen Sie die zuletzt erstellten maskierten Kanäle. </li><li> Wählen Sie alle verfügbaren Daten. Es gibt dunkle Pixel, die manchmal nach der Analyse vorhanden sind. Diese Pixel im Histogramm Wählen Sie nicht, werden sie die Ergebnisse verfälschen. </li><li> In der rechten Panel, wählen Sie &quot;Build Coloc Kanal &#39;. Dadurch wird ein neuer Kanal, der nur die colokalisiert Pixel. Die Daten werden in der gleichen Blende unter der &quot;Channel Statistiken&quot; Knopf sein. Die Daten können als CSV-Datei exportiert werden. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Percent of Material kolokalisiert&quot; Statistik. Diese Option berücksichtigt die Intensität der Pixel und die Größe des Objekts. </li></ol></li></ol>

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	<li>Masters, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+plaque+core+protein+in+Alzheimer+disease+and+Down+syndrome.">Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).</li><li>Vassar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase+cleavage+of+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+by+the+transmembrane+aspartic+protease+BACE.">Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE.</a> Science. 286 (5440), 735-741 (1999).</li><li>De Strooper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+presenilin-1+inhibits+the+normal+cleavage+of+amyloid+precursor+protein.">Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein.</a> Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+complexes+with+the+C-terminal+fragments+of+amyloid+precursor+protein+at+the+sites+of+amyloid+beta-protein+generation.">Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).</li><li>Li, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+is+linked+with+gamma-secretase+activity+in+the+detergent+solubilized+state.">Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).</li><li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+enhanced+amyloidogenicity+of+Alzheimer+A{beta}42+peptide+relative+to+A{beta}40.">Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40.</a> J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).</li><li>Pawar, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+'aggregation-prone'+and+"aggregation-susceptible.">Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible.</a> J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+haploinsufficiency+increases+Alzheimer's+disease+neuropathology.">VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology.</a> J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).</li><li>Rogaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+sortilin-related+receptor+SORL1+is+genetically+associated+with+Alzheimer+disease.">The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease.</a> Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).</li><li>Andersen, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sorting+protein-related+receptor+sorLA/LR11+regulates+processing+of+the+amyloid+precursor+protein.">Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).</li><li>Schmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA/LR11+regulates+processing+of+amyloid+precursor+protein+via+interaction+with+adaptors+GGA+and+PACS-1.">SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1.</a> J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).</li><li>Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+anti-amyloid+immunotherapy+in+Alzheimer's+disease:+What+are+the+most+promising+targets.">Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets.</a> Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).</li><li>Pasternak, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1,+nicastrin,+amyloid+precursor+protein,+and+gamma-secretase+activity+are+co-localized+in+the+lysosomal+membrane.">Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane.</a> J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).</li><li>Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alkalizing+agents+on+the+processing+of+the+beta-amyloid+precursor+protein.">Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein.</a> Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).</li><li>Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+the+amyloid+protein+precursor+to+potentially+amyloidogenic+derivatives.">Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.</a> Science. 255 (5045), 728-730 (1992).</li><li>Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+beta-amyloid+formation+identifies+proteolytic+precursors+and+subcellular+site+of+catabolism.">Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism.</a> Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+Fragments+of+Alzheimer+beta+-Amyloid+Precursor+Protein+Accumulate+in+Restricted+and+Unpredicted+Intracellular+Compartments+in+Presenilin+1-deficient+Cells.">Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells.</a> J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).</li><li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+identifies+new+signals+for+beta-amyloid+precursor+protein+endocytosis,+turnover,+and+the+generation+of+secreted+fragments,+including+Abeta42.">Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42.</a> J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).</li><li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Is+Required+for+Synaptic+Activity-Dependent+Release+of+Amyloid-&#946;+In+Vivo.">Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-&#946; In Vivo.</a> Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).</li><li>Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dynamin-dependent+endocytosis+increases+shedding+of+the+amyloid+precursor+protein+ectodomain+and+reduces+generation+of+amyloid+beta+protein.">Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein.</a> BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).</li><li>Traub, L. M., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans-Golgi+network:+a+late+secretory+sorting+station.">The trans-Golgi network: a late secretory sorting station.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).</li><li>Vieira, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+the+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+from+the+endosome+to+the+TGN+is+S655+phosphorylation+state-dependent+and+retromer-mediated.">Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated.</a> Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).</li><li>Sullivan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+disruption+promotes+amyloidogenic+APP+processing.">Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing.</a> Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).</li><li>Fjorback, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+binds+the+FANSHY+sorting+motif+in+SorLA+to+regulate+amyloid+precursor+protein+sorting+and+processing.">Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing.</a> J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+GFP+for+Selective+Photolabeling+of+Proteins+and+Cells.">A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Diese Technik beschreibt die genaue Photoaktivierung von Membranproteinen mit paGFP getaggt im TGN, um nachfolgende Handel und Spaltung zu visualisieren. Während paGFP wurde vor über einem Jahrzehnt 25 erstellt, ist dies das erste Beispiel für eine genaue Photoaktivierung zur Verhinderung des Handels mit freiwerdenden Proteine ​​an nachgeschaltete Kammern folgen. Frühere Studien mit APP-paGFP Konstrukte photoaktivierten eine peri-Kernbereich der Zelle, die als auf der Golgi 11 sein. Jedoch,...

Das Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) ist die Anwesenheit von senilen Plaques und neurofibrillären Tangles (NFT) im Gehirn. Der Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellt β-Amyloid (Aß). Aß wird aus seinem Vorläufer abgeleitet ist; Amyloid-Vorläuferprotein (APP) 1. Das amyloidogene Spaltung von APP beginnt mit der Entfernung von der Ektodomäne von APP durch β-Sekretase-2. Die restlichen 99-Rückstand carboxyterminale Fragment (CTF) durch γ-Sekretase gespalten werden, um Aß 3-7 herzustellen. Während viele Experimente haben die Spaltung der Zelloberflächen-APP nach Internalisierung von der Zelloberfläche in das endosomale / lysosomale System dokumentiert, wurde eine Anzahl von jüngsten Studien vorgeschlagen, den intrazellulären Transport von APP ist auch bei der Regulierung der Verarbeitung 8-11 wichtig. Es gab eine Reihe von Versuchen bei der Modulation der Niveaus von Aß mit γ-Sekretase-Inhibitoren und Aß immun gewesenotherapies. Allerdings haben neuere klinische Studien mit diesen Therapien zeigten keinen Vorteil, und in einigen Fällen eine Erhöhung der Schaden 12. Ein ungenutztes Strategie Aß Produktion modulieren, um die subzelluläre Lokalisation von APP und γ-Sekretase-Wechselwirkung verändern. Die Golgi, Plasmamembran und Endosomen / Lysosomen wurden alle als mögliche Schauplätze für γ-Spaltung von APP wurde vorgeschlagen. Forschung aus unserem Labor legt nahe, dass APP und die γ-Sekretase ansässig sind Proteine ​​der lysosomalen Membran 13. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die lysosomale γ-Sekretase einen sauren pH-Optimum 13. Zusätzlich Alkalisierung der endosomalen / lysosomalen System mit Chloroquin oder NH 4 Cl, wurde gezeigt, dass die Produktion von A &amp; bgr; 14 zu verringern. y-Sekretase Inhibition oder Knockout oder Presenilin führt zu APP-CTFs Ansammlung im Lysosom 15-17. Darüber hinaus stören APP Endozytose senkt Aß Produktion 18-20. Trotz der Bedeutung der Golgi als Sortierstation für naszierende Proteine ​​und Proteine ​​aus dem endosomalen / lysosomalen System zurückgeführt wird, hat die den intrazellulären Transport von APP nicht ausführlich 21 untersucht. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass APP kann dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) über die Interaktion mit dem Komplex Retromer recycelt werden. Herunterregulierung des Retromer Komplex abnimmt Aß Produktion 8,22-24. Jedoch der Austritt von APP vom Golgi wurde noch nicht ausreichend untersucht. Beim Folgen der Endozytose von Zelloberflächenproteine, wie Transferrin-Rezeptors sind, leicht markiert und anschließend, nach dem Handel von intrazellulären Proteinen ist schwieriger. In der Tat haben einige Proteine ​​hatten ihre intrazellulären Transport abgebildet. Das Aufkommen von fluoreszierenden Protein-Tags, wie photoaktivierbare-GFP (paGFP), hat neue Tools bereitgestellt, um intrazellulären Transport zu untersuchen. Photoaktivierbare-GFP ist eine Form von GFP, die nach der Synthese nahezu unsichtbar ist, aber entwickelt sich stark grün (GFP) Fluoreszenz, nachdem sie von 413 nm Laserlicht aktiviert, und dieses Signal für die Tage 25,26 stabil ist. Konstrukte mit paGFP wurden verwendet, um die intralysosomalen Handel des lysosomalen Proteins nachweisen membrane protein 1 (LAMP1) 25, die Zelloberfläche Lieferung des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG, ein Marker für den sekretorischen Weg) 27, und der Umsatz von Peroxisomen 28 und 29 Autophagosomen. Um die Sortierung von APP aus dem TGN in lebenden Zellen sichtbar, haben wir Plasmid, die letzten 112 Aminosäuren von APP zu photoaktivierbare (paGFP) auf der C-terminalen 30 verbunden (als &amp; beta; APP-paGFP bezeichnet). Wir haben auch durchgeführt, diese Experimente mit voller Länge APP und erzielte ähnliche Ergebnisse; die &amp; beta; APP-Konstrukt wird hier verwendet, da es ein helleres Bild. Wir haben dann Foto-activate &amp;# 946; APP-paGFP nur in dem TGN, wie durch den TGN Marker Galactosyltransferase (GalT) abgegrenzt. Obwohl APP mit paGFP getaggt worden, um schnellen axonalen Transport von APP und Abstand von der perinukleären Region sichtbar zu machen, ist dies die erste Demonstration von APP Handel von einer sorgfältig definierten Fach zu einem anderen 11,31,32. Hier zeigen wir eine genaue Photoaktivierung im TGN und den Austritt von APP in nachgeschaltete Fächern und anschließende Spaltung und Clearance von Lysosomen 30. Die exakte Photoaktivierung im Golgi ist weit auf anderen Proteinsystemen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-Amyloid (Aß) ist der Hauptbestandteil von senilen Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten gefunden. Aß wird aus der sequentiellen Spaltung des Amyloid-Vorläuferprotein (APP), die durch β und γ-Sekretasen abgeleitet. Trotz der Bedeutung von Aß zu AD-Pathologie ist die subzelluläre Lokalisation dieser Spaltungen nicht gut etabliert. Arbeiten in unserem Labor und andere implizieren die endosomale / lysosomale System in APP-Prozessierung nach der Internalisierung von der Zelloberfläche. Allerdings ist die intrazellulären Transport von APP relativ wenig unter. Während Zelloberflächenproteine ​​sind abänderbar viele Markierungstechniken, es gibt keine einfachen Methoden zum Folgen des Handels mit Membranproteinen vom Golgi. Zu diesem Zweck haben wir APP-Konstrukte, die mit photoaktivierbaren GFP (paGFP) gekennzeichnet wurden, am C-Terminus hergestellt. Nach der Synthese hat paGFP niedrigen Grundfluoreszenz, aber es kann mit 413-nm-Licht t stimuliert werdeno erzeugen eine starke, stabile grüne Fluoreszenz. Mithilfe der Golgi Marker Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein (GalT-GFP) als Ziel verbunden ist, sind wir in der Lage, genau zu photoaktivieren APP in dem Trans-Golgi-Netzwerk. Photo-aktivierte APP-paGFP kann dann verfolgt werden, wie es Verkehre an nachgeschaltete Fächer mit fluoreszenz identifiziert getaggt Fach Markerproteine ​​für die frühe Endosomen (Rab5), den späten Endosomen (Rab9) und Lysosom (LAMP1). Außerdem wurde unter Verwendung Inhibitoren APP Verarbeitung einschließlich Chloroquin oder der γ-Sekretase-Inhibitor-L685, 458, können wir die Pulse-Chase-Experimente durchzuführen, um die Verarbeitung von APP in einzelnen Zellen zu untersuchen. Wir finden, dass ein großer Anteil von APP schnell bewegt zum Lysosom, ohne an der Zelloberfläche erscheinen, und wird dann aus dem Lysosom durch Sekretase-ähnliche Spaltungen gelöscht. Diese Technik zeigt die Nützlichkeit paGFP zum Folgen des Menschenhandels und die Verarbeitung von intrazellulären Proteinen herm die Golgi an nachgeschaltete Kammern.

Typische Ergebnisse zeigen ßAPP Verlassen des TGN und scheint Verkehr schnell auf LAMP1 (Abbildung 1a und b). Während der Photoaktivierung Zeit können Vesikel gesehen Verlassen der Golgi für Lysosomen (Abbildung 1b) bestimmt werden. Ohne Inhibitor Behandlung wird paGFP Fluoreszenz in Lysosomen sichtbar sein, während es Photoaktivierung im TGN. Nach dem Anhalten der Photoaktivierung wird der &amp; bgr; APP-paGFP schnell aus dem Lysosom gelöscht (vergleiche ...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Aufrufe.  Western University.  Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum. 