This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. Zell Plating und Transfektion <ol><li> In einer Zellkultur Kapuze, Platte ~ 300.000 bis ~ 500.000 SN56-Zellen (ein freundliches Geschenk von Dr. Jane Rylett) auf einer 35 mm Glasboden konfokalen Teller geben und mit vorge Transfektionsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, DMEM, ergänzt mit 10% FBS). </li><li> Zellen beimpft und über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator zu vermehren. Hinweis: Die Zellen sollten ca. 50% -70% konfluent vor der Transfektion werden. </li><li> In einem Zellkulturhaube, transfizierenden Zellen mit Plasmiden, ein fluoreszierendes Protein exprimieren, markiert TGN Markierung (Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein gekoppelt ist, GalT-GFP), ein fluoreszierendes Protein markiert Fach Marker (hier Lysosom assoziiertes Membranprotein 1, LAMP1, getaggt mRFP) und das Protein von Interesse mit paGFP (&amp; beta; APP-paGFP markiert). (Diese Konstrukte sind zuvor beschrieben worden, 30) </li><li> Zellen mit Transfektionsreagenz und Plasmid-DNA f inkubierenoder 24 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Verwenden Sie ein Verhältnis von ~ 2 ug DNA zu 5 ul Transfektionsagens (zB Lipofectamin 2000), um ein optimales Gleichgewicht Zytotoxizität und Transfektionseffizienz. Tatsächlichen Konzentrationen eventuell auf unterschiedlichen Plasmiden optimiert werden. In den hier beschriebenen Experimenten verwenden 1 ug / konfokalen Gericht von &amp; bgr; APP-paGFP, 0,3 ug / konfokalen Gericht aus LAMP1-mRFP und 0,2 ug / konfokalen Gericht aus GalT-GFP. Anmerkung: Die Menge des verwendeten Plasmids wird auf die Transfektionseffizienz abhängen. </li><li> Für neuronale Zellinien: Nach dem Schritt 1.4, in einem Zellkulturhaube Entfernen vorge Transfektionsmedium und Differenzierung SN56-Zellen in 2 ml DMEM mit 0,1% Penicillin / Streptomycin, ergänzt mit 1 mM Dibutyryl-cyclisches AMP (dbcAMP) für 24 Std. </li></ol> 2. Mikroskop Bühne Vorbereitung <ol><li> Vorwärmen phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) bis 37 ° C. Warm-up vor dem Mikroskoptisch Imaging bis 37 ° C. </li><li> Wash Zellen zweimal mit PBS, um die Differenzierung Medien entfernen und ersetzen Sie mit 2 ml HBSS bei 37 ° C. Ortszellen am Mikroskoptisch erwärmt auf 37 ° C. Hinweis: Zellen lebensfähig für ca. 1,5 bis 2 h in HBSS sind. </li><li> Lassen Sie 5-10 Minuten für die konfokale Plattentemperatur mit dem Mikroskoptisch ins Gleichgewicht. </li></ol> 3. Foto-Aktivierung von ROIs über den Golgi <ol><li> Mit dem Mikroskop-Okular, finden Sie Zellen mit GalT-CFP, LAMP1-mRFP und &amp; bgr; APP-paGFP transfiziert. <ol><li> Verwenden Sie eine Öl-Immersionslinse mit hoher Vergrößerung (dh 63X oder 100X). Zur optischen Konformation der Fluoreszenz, verwenden Sie einen Filter zu setzen in der Lage ist die Visualisierung FITC (für GFP und GFP-Fluoreszenz) und Rhodamin (für mRFP Fluoreszenz). </li></ol></li><li> Stellen Sie die konfokale Scheibe für jeden Kanal bis 1 um. Nehmen Sie ein Bild mit niedriger Auflösung. </li><li> Crop für Bild nur die Zelle von Interesse. </li><li> Verwenden Sie den Einstellknopf, manuell eingestelltdie Brennebene zu der Mitte der Zelle. Dies ist typischerweise der Teil der Zelle, wo der Kern der größte ist. </li><li> Draw 3-5 kreisförmige Regionen of Interest (ROIs) innerhalb des TGN (GalT-GFP-Fluoreszenz). <ol><li> So zeichnen ROIs (dh in der Zeiss LSM-Programm), wählen Sie &quot;Bearbeiten ROI &#39;Schaltfläche in der Befehlskonsole. </li><li> Wählen Sie das kreisförmige ROI-Taste. </li><li> Klicken und ziehen Sie über GalT-GFP positive Regionen der Zelle. Hinweis: Die Photobleaching-Pakete für viele Mikroskope haben diese Fähigkeit. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Bild von der Zelle mit dem überlagerten ROIs. Speichern Sie eine Kopie der ROIs zur späteren Referenz. <ol><li> Um die ROIs auf das Bild zu speichern, wählen Sie den &quot;Makro&quot; -Taste. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Laden&quot;, um die &quot;CopyRoisToOverlay&quot; (Dateipfad: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb) starten. Hinweis: ein konfokales Mikroskop mit 475 bis 525 nm (GFP) Bandpass (BP), eine 500 bis 530 nm BP (GFP) ausgestattet,und ein 560 nm langen Pass (LP) Filtersätze sind erforderlich. Ein Argon-Laser für 458 nm und 488 nm Emission und einem HeNe-Laser für 540 nm-Emission ist ebenfalls erforderlich. </li></ol></li><li> Set-up des Mikroskops für eine Bleichzeitverlauf. <ol><li> Stellen Sie die Laserdiode (25 mW 405 nm Laser), um maximale Leistung. Vorsicht: Übermäßiger Photoaktivierung könnte zu produzieren Foto-Toxizität oder Schäden an Zellmembranen führen. Augenschutz benutzen, um Netzhautschäden zu vermeiden. </li><li> Set-up das Mikroskop für 120 Zyklen der Bildgebung. Hinweis: eine Abbildungszyklus besteht aus Bleich innerhalb der ROIs und Bilderzeugung der gesamten Zelle. Dies ist ein Bleichzeitverlauf. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop zu bleichen (Foto deaktivieren) nur die ROIs für 20-30 Iterationen nach jedem Bild. Die Zeit, um das Bild und Bleichmittel ein Bild variieren. Festlegen einer Zeitverzögerung zwischen den Bildern, so dass jeder Zyklus etwa 30 Sekunden. Hinweis: Der Abbildungsteil jedes Zyklus dauert etwa 15-30 sec, je nach Größe des Bildes. Die Bleich für jedes ROI ist etwa 50 msec. Bleich aller 4 ROIs 20 Iterationen 4 Sekunden am Ende jedes Bleichmittel / Bildzyklus zu nehmen. </li></ol></li><li> Starten Sie das Bleichzeitverlauf. </li><li> Ausschalten des Bleich nach 15 min (30 Zyklen von Bildgebung und Bleichen), sondern weiterhin die Aufnahme von Bildern der Zelle. Hinweis: Zeit 0 bis 15 min ist der &quot;Puls&quot; Periode. </li><li> Weitere Bilder aufzunehmen für 45 min (ohne Bleichen), um den Abstand von &amp; bgr; APP-paGFP folgen. Hinweis: Zeit 15 bis 45 Minuten ist die &quot;Jagd&quot; Periode. </li><li> Unter Verwendung der in Schritt 6 beschriebenen Analyseverfahren, Co-Lokalisation des Proteins von Interesse (hier ßAPP-paGFP) mit dem Fach von Interesse (hier LAMP1-mRFP), indem sie Flächen für jeden Kanal. </li></ol> 4. Bestimmen Sie die Downstream-Compartments <ol><li> Um festzustellen, ob Lysosomen (in diesen Experimenten) sind die letzte Kammer, fügen membranpermeablen Protease-Inhibitoren, um zu bewirken Proteine ​​im Lysosom anreichern.<ol><li> Für ßAPP, verwenden Sie 0,5 um L685, 458 (spezifische γ-Sekretase-Hemmer) über Nacht oder 100 uM Chloroquin (entsäuert Lysosomen) 30 Minuten vor der Bildgebung. </li></ol></li><li> Finden Zellen und photoaktivieren, wie in Schritt 3,1 bis 3,8. </li><li> Bild die Zelle für ein zusätzliches 45-min (ohne Photoaktivierung) zu bestimmen, wo &amp; beta; APP-paGFP sammelt sich in Abwesenheit von Spaltung. </li><li> Analysieren die Lieferung von Protein zu Lysosomen (oder andere stromab gelegene Abteil) und anschließender Abstand entsprechend dem in Schritt 6 beschriebenen Verfahren. </li></ol> 5. Stellen Sie sicher Genauigkeit der Photoaktivierung im Golgi <ol><li> Aufwärm HBSS auf 37 ° C. </li><li> Bereiten eine 2 ml Lösung zu jedem konfokalen Platte abgebildet werden, von 66 &amp; mgr; M Nocodazol (Behandlung) oder DMSO (Kontrolle) in HBSS. <ol><li> Zum einen konfokalen Platte, Pipette 2 ml 37 ° C HBSS und fügen 7,96 ul Nocodazol aus einem 16,60 mM Nocodazol Lager. </li><li> Als Kontrolle solution, Pipette 2 ml 37 ° C HBSS in ein 2-ml-Tube und füge 7,96 ul DMSO. </li></ol></li><li> Zellen in HBSS mit Nocodazol oder DMSO Inkubation für 5 min vor der Bildgebung. </li><li> Finden Zellen wie in Schritt 3.1. </li><li> Vor der Photoaktivierung, bereiten Sie das Mikroskop, um eine Z-Stapel nach der Photoaktivierung Zeitraum. <ol><li> Klicken Sie auf das &quot;Z-Stapel&quot; Taste. Starten Sie das Scannen unter Verwendung der schnellen XY. </li><li> Stellen Sie die Brennebene mit dem Mikroskop Einstellknopf an die Spitze der Zelle. Drücken Sie &#39;Mark First&#39;, um die erste Position in dem Stapel gesetzt. </li><li> Einstellen der Brennebene der Mikroskop Einstellknopf am Boden (in der Nähe des Glases) der Zelle. Drücken Sie &#39;Mark Last&#39;, um die letzte Position im Stapel gesetzt. </li><li> In der Stapeltafel Z, drücken Sie die &quot;Z Schneiden &#39;button. Stellen Sie die &quot;Intervall&quot; bis 1 um. Hinweis: Für eine höhere räumliche Auflösung Stapel einen kleineren Stack Intervall, aber mehr Bilder werden zu müssen,Verlängerung der Frist für die Bildgebung des Stapels genommen werden. </li></ol></li><li> Bleichen der Zellen, wie in Schritt 3,7-3,8 beschrieben. Foto-activate und Bild von 0 min bis 15 min (30 Bilder). </li><li> Stoppen Bildgebung nach 30 Bildern. Ein Bild des Videos sofort zu speichern. Achtung: Einige Mikroskope können erste Video zu überschreiben, wenn es nicht vor dem Start eines zweiten Bildsequenz gespeichert. </li><li> Nach dem Speichern des Videos sofort erwerben ein Z-Stack, mit den Parametern von Schritt 5.5. </li><li> Kolokalisieren ßAPP-paGFP mit GalT-GFP (oder andere Golgi-Marker), wie in Schritt 6 beschrieben. Hinweis: CFP Photobleichmittel schneller und möglicherweise nicht sichtbar durch das Ende des bildgebenden Zeitraum. Kolokalisation nicht möglich mit GalT-GFP sein. Wenn Kolokalisation benötigt wird, verwenden, um mRFP GalT taggen. </li></ol> 6. Vesicle Filtern und Kolokalisation <ol><li> Verwenden Sie ein Analyseprogramm (zB Imaris) auf Oberflächen von dem Fach (zB LAMP1-mRFP) und ein Protein o machenf Interesse (zB &amp; bgr; APP-paGFP). </li><li> Geben Sie im Abschnitt &quot;Surpass&quot; des Analyse-Programm, indem Sie auf die Schaltfläche Übertreffen auf der oberen Menüleiste. </li><li> Wählen Sie die Fläche Assistenten Taste an der Oberseite des äußersten linken Panel (5. Taste von links). </li><li> Wählen Sie einen Kanal, um Vesikel (dh &amp; bgr; APP-paGFP Fluoreszenz Protein von Interesse) filtern. </li><li> Führen Hintergrundsubtraktion durch Vorlage des Durchmessers der größten Vesikel in das Feld mit dem Assistenten ein und klicken Sie auf Weiter. Das Analyseprogramm wählt automatisch - basierend auf einem Schwellenwert von der größten Vesikel im Bereich abgeleitet - ein Bereich, in dem interessierenden Kanal. <ol><li> Manuelle Einstellung der Schwelle Hintergrund, um die Auswahl zu verfeinern, wenn nötig. </li></ol></li><li> An der Unterseite des Threshold-Auswahlbildschirm, überprüfen Option &#39;Split berührende Objekte&#39;, um den kombinierten Oberflächen zu trennen. Hinweis: Wenn viele Vesikel sind eng gruppiertzusammen, die Analyse-Programm-Gruppe diese Objekte unter einer Oberfläche. <ol><li> Wählen 10-15 repräsentativen Vesikel und die Berechnung der durchschnittliche Vesikeldurchmesser und geben Sie das Ergebnis in den Assistenten. </li></ol></li><li> Verfeinern Sie die ausgewählten Saatpunkte durch Erhöhen oder Verringern der Schwelle auf &quot;Qualität&quot; (Intensität des Kanals in der Mitte jeder Ort). Hinweis: Die Oberflächen des Kanals von Interesse erzeugt. Eine weitere Verfeinerung der ausgewählten Flächen kann an dieser Stelle durchgeführt werden. Schwelle Vesikel auf Basis der Anzahl der Pixel in jedem Vesikel. </li><li> Maske der ursprünglichen Kanal mit dieser Oberfläche. Zu maskieren, wählen Sie die Registerkarte 4. von links in der Oberflächenerstellungsassistenten (Bleistift). </li><li> Wählen Sie &#39;Mask All&#39;. Ein neuer Kanal mit den Vesikeln von Interesse erzeugt. Hinweis: Während des Maskenprozess, ist eine Option, um den ursprünglichen Kanal zu duplizieren angeboten. Wählen Sie diese Option, wenn die Originaldaten gespeichert werden muss. </li><li> Wiederholungen sTEPs 6.1 bis 6.7 für das ungefilterte Kanal (dh LAMP1 mRFP, Fach). </li><li> An der oberen Werkzeugleiste, wählen Sie die Kolokalisation Werkzeug. <ol><li> In der oberen Platte, wie die Histogramme der Kanäle zu kolokalisiert zu sein scheinen, wählen Sie die zuletzt erstellten maskierten Kanäle. </li><li> Wählen Sie alle verfügbaren Daten. Es gibt dunkle Pixel, die manchmal nach der Analyse vorhanden sind. Diese Pixel im Histogramm Wählen Sie nicht, werden sie die Ergebnisse verfälschen. </li><li> In der rechten Panel, wählen Sie &quot;Build Coloc Kanal &#39;. Dadurch wird ein neuer Kanal, der nur die colokalisiert Pixel. Die Daten werden in der gleichen Blende unter der &quot;Channel Statistiken&quot; Knopf sein. Die Daten können als CSV-Datei exportiert werden. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Percent of Material kolokalisiert&quot; Statistik. Diese Option berücksichtigt die Intensität der Pixel und die Größe des Objekts. </li></ol></li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Diese Technik beschreibt die genaue Photoaktivierung von Membranproteinen mit paGFP getaggt im TGN, um nachfolgende Handel und Spaltung zu visualisieren. Während paGFP wurde vor über einem Jahrzehnt 25 erstellt, ist dies das erste Beispiel für eine genaue Photoaktivierung zur Verhinderung des Handels mit freiwerdenden Proteine ​​an nachgeschaltete Kammern folgen. Frühere Studien mit APP-paGFP Konstrukte photoaktivierten eine peri-Kernbereich der Zelle, die als auf der Golgi 11 sein. Jedoch,...

Das Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) ist die Anwesenheit von senilen Plaques und neurofibrillären Tangles (NFT) im Gehirn. Der Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellt β-Amyloid (Aß). Aß wird aus seinem Vorläufer abgeleitet ist; Amyloid-Vorläuferprotein (APP) 1. Das amyloidogene Spaltung von APP beginnt mit der Entfernung von der Ektodomäne von APP durch β-Sekretase-2. Die restlichen 99-Rückstand carboxyterminale Fragment (CTF) durch γ-Sekretase gespalten werden, um Aß 3-7 herzustellen. Während viele Experimente haben die Spaltung der Zelloberflächen-APP nach Internalisierung von der Zelloberfläche in das endosomale / lysosomale System dokumentiert, wurde eine Anzahl von jüngsten Studien vorgeschlagen, den intrazellulären Transport von APP ist auch bei der Regulierung der Verarbeitung 8-11 wichtig. Es gab eine Reihe von Versuchen bei der Modulation der Niveaus von Aß mit γ-Sekretase-Inhibitoren und Aß immun gewesenotherapies. Allerdings haben neuere klinische Studien mit diesen Therapien zeigten keinen Vorteil, und in einigen Fällen eine Erhöhung der Schaden 12. Ein ungenutztes Strategie Aß Produktion modulieren, um die subzelluläre Lokalisation von APP und γ-Sekretase-Wechselwirkung verändern. Die Golgi, Plasmamembran und Endosomen / Lysosomen wurden alle als mögliche Schauplätze für γ-Spaltung von APP wurde vorgeschlagen. Forschung aus unserem Labor legt nahe, dass APP und die γ-Sekretase ansässig sind Proteine ​​der lysosomalen Membran 13. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die lysosomale γ-Sekretase einen sauren pH-Optimum 13. Zusätzlich Alkalisierung der endosomalen / lysosomalen System mit Chloroquin oder NH 4 Cl, wurde gezeigt, dass die Produktion von A &amp; bgr; 14 zu verringern. y-Sekretase Inhibition oder Knockout oder Presenilin führt zu APP-CTFs Ansammlung im Lysosom 15-17. Darüber hinaus stören APP Endozytose senkt Aß Produktion 18-20. Trotz der Bedeutung der Golgi als Sortierstation für naszierende Proteine ​​und Proteine ​​aus dem endosomalen / lysosomalen System zurückgeführt wird, hat die den intrazellulären Transport von APP nicht ausführlich 21 untersucht. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass APP kann dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) über die Interaktion mit dem Komplex Retromer recycelt werden. Herunterregulierung des Retromer Komplex abnimmt Aß Produktion 8,22-24. Jedoch der Austritt von APP vom Golgi wurde noch nicht ausreichend untersucht. Beim Folgen der Endozytose von Zelloberflächenproteine, wie Transferrin-Rezeptors sind, leicht markiert und anschließend, nach dem Handel von intrazellulären Proteinen ist schwieriger. In der Tat haben einige Proteine ​​hatten ihre intrazellulären Transport abgebildet. Das Aufkommen von fluoreszierenden Protein-Tags, wie photoaktivierbare-GFP (paGFP), hat neue Tools bereitgestellt, um intrazellulären Transport zu untersuchen. Photoaktivierbare-GFP ist eine Form von GFP, die nach der Synthese nahezu unsichtbar ist, aber entwickelt sich stark grün (GFP) Fluoreszenz, nachdem sie von 413 nm Laserlicht aktiviert, und dieses Signal für die Tage 25,26 stabil ist. Konstrukte mit paGFP wurden verwendet, um die intralysosomalen Handel des lysosomalen Proteins nachweisen membrane protein 1 (LAMP1) 25, die Zelloberfläche Lieferung des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG, ein Marker für den sekretorischen Weg) 27, und der Umsatz von Peroxisomen 28 und 29 Autophagosomen. Um die Sortierung von APP aus dem TGN in lebenden Zellen sichtbar, haben wir Plasmid, die letzten 112 Aminosäuren von APP zu photoaktivierbare (paGFP) auf der C-terminalen 30 verbunden (als &amp; beta; APP-paGFP bezeichnet). Wir haben auch durchgeführt, diese Experimente mit voller Länge APP und erzielte ähnliche Ergebnisse; die &amp; beta; APP-Konstrukt wird hier verwendet, da es ein helleres Bild. Wir haben dann Foto-activate &amp;# 946; APP-paGFP nur in dem TGN, wie durch den TGN Marker Galactosyltransferase (GalT) abgegrenzt. Obwohl APP mit paGFP getaggt worden, um schnellen axonalen Transport von APP und Abstand von der perinukleären Region sichtbar zu machen, ist dies die erste Demonstration von APP Handel von einer sorgfältig definierten Fach zu einem anderen 11,31,32. Hier zeigen wir eine genaue Photoaktivierung im TGN und den Austritt von APP in nachgeschaltete Fächern und anschließende Spaltung und Clearance von Lysosomen 30. Die exakte Photoaktivierung im Golgi ist weit auf anderen Proteinsystemen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-Amyloid (Aß) ist der Hauptbestandteil von senilen Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten gefunden. Aß wird aus der sequentiellen Spaltung des Amyloid-Vorläuferprotein (APP), die durch β und γ-Sekretasen abgeleitet. Trotz der Bedeutung von Aß zu AD-Pathologie ist die subzelluläre Lokalisation dieser Spaltungen nicht gut etabliert. Arbeiten in unserem Labor und andere implizieren die endosomale / lysosomale System in APP-Prozessierung nach der Internalisierung von der Zelloberfläche. Allerdings ist die intrazellulären Transport von APP relativ wenig unter. Während Zelloberflächenproteine ​​sind abänderbar viele Markierungstechniken, es gibt keine einfachen Methoden zum Folgen des Handels mit Membranproteinen vom Golgi. Zu diesem Zweck haben wir APP-Konstrukte, die mit photoaktivierbaren GFP (paGFP) gekennzeichnet wurden, am C-Terminus hergestellt. Nach der Synthese hat paGFP niedrigen Grundfluoreszenz, aber es kann mit 413-nm-Licht t stimuliert werdeno erzeugen eine starke, stabile grüne Fluoreszenz. Mithilfe der Golgi Marker Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein (GalT-GFP) als Ziel verbunden ist, sind wir in der Lage, genau zu photoaktivieren APP in dem Trans-Golgi-Netzwerk. Photo-aktivierte APP-paGFP kann dann verfolgt werden, wie es Verkehre an nachgeschaltete Fächer mit fluoreszenz identifiziert getaggt Fach Markerproteine ​​für die frühe Endosomen (Rab5), den späten Endosomen (Rab9) und Lysosom (LAMP1). Außerdem wurde unter Verwendung Inhibitoren APP Verarbeitung einschließlich Chloroquin oder der γ-Sekretase-Inhibitor-L685, 458, können wir die Pulse-Chase-Experimente durchzuführen, um die Verarbeitung von APP in einzelnen Zellen zu untersuchen. Wir finden, dass ein großer Anteil von APP schnell bewegt zum Lysosom, ohne an der Zelloberfläche erscheinen, und wird dann aus dem Lysosom durch Sekretase-ähnliche Spaltungen gelöscht. Diese Technik zeigt die Nützlichkeit paGFP zum Folgen des Menschenhandels und die Verarbeitung von intrazellulären Proteinen herm die Golgi an nachgeschaltete Kammern.

Typische Ergebnisse zeigen ßAPP Verlassen des TGN und scheint Verkehr schnell auf LAMP1 (Abbildung 1a und b). Während der Photoaktivierung Zeit können Vesikel gesehen Verlassen der Golgi für Lysosomen (Abbildung 1b) bestimmt werden. Ohne Inhibitor Behandlung wird paGFP Fluoreszenz in Lysosomen sichtbar sein, während es Photoaktivierung im TGN. Nach dem Anhalten der Photoaktivierung wird der &amp; bgr; APP-paGFP schnell aus dem Lysosom gelöscht (vergleiche ...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Aufrufe.  Western University.  Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum. 

Serie: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Forschung

Biologie

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.