Borrelien sind eine Gattung von Spirochäten, die drei Hauptarten umfasst. Die Lyme-Borreliose-Gruppe, die Rückfallfieber-Gruppe und die weniger gut charakterisierte Gruppe, die bei Reptilien zu finden ist. Viele Borrelienarten sind pathogen.
Die Bakterienkultur ist der Goldstandard für den Nachweis von Infektionen. Dies gilt sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit. Die Kultivierung von Bakterien aus Körperflüssigkeit und Gewebe bestätigt, dass die Bakterien sowohl lebensfähig sind als auch sich vermehren.
Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung und Konservierung der Lyme-Borreliose-Gruppe von Spirochäten, Rückfallfieber-Borrelien und Borrelia miyamotoi erforderlich sind. Es werden Methoden für die Kultivierung von zuvor isolierten Arten und Stämmen sowie für neue Isolate und monoklonale Isolate aus Umwelt- oder Säugetierquellen bereitgestellt. Marie-Line Faucillion, Postdoktorandin, und Ingela Nilsson, Technikerin aus dem Bergstrom Lab, Anne Berthold, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Lloyd Lab, und Maryna Golovchenko, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Rudenko Lab, demonstrieren das Verfahren.
Besorge dir zunächst die Reagenzien, die für die Herstellung eines Liters Barbara-Stoner-Kelly- oder BSK-II-Medium erforderlich sind. Beginnen Sie mit dem Auflösen des BSA in einem Becherglas, indem Sie das Wasser umrühren. Fügen Sie dann alle trockenen Chemikalien hinzu und lassen Sie sie sich auflösen, bevor Sie CMRL hinzufügen.
Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf 7,6 ein. Verwenden Sie bei Bedarf eine molare Natronlauge. Als nächstes fügen Sie dem Medium Kaninchenserum in einer Konzentration von sechs bis 10 % hinzuWenn das Bakterienwachstum nicht stark ist, fügen Sie dem Medium ein weiteres bis 2%iges Serum hinzu.
Anschließend sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22-Mikron-Porenfilter. Frieren Sie die Brühe des Mediums in 100 oder 400 Milliliter Aliquots ein. Bei Stämmen mit rückfälligem Fieber fügen Sie 100 Milliliter 7%ige sterile Gelatine zu 400 Millilitern BSK-II-Medium hinzu.
Desinfizieren Sie die Oberfläche und alle Materialien mit 7%Ethanol und übergeben Sie diese sofort in die biologische Sicherheitswerkbank. UV-sterilisieren Sie alle nicht-biologischen Materialien fünf Minuten vor Beginn der Arbeit. Um eine Kultur zu starten, wärmen Sie das Medium in einem Inkubator vor.
Dann einen Milliliter aufgetaute Borrelienkultur aus einer Glycerinbrühe auf fünf bis 15 Milliliter vorgewärmtes BSK-Medium geben. Füllen Sie die Röhrchen fast vollständig, um eine mikro- oder anaerobe Atmosphäre zu schaffen, bevor Sie sie schließen. Züchten Sie Rückfallfieber-Arten bei 37 Grad Celsius und Borrelia burgdorferi sensu lato-Arten bei 33 bis 34 Grad Celsius.
Überwachen Sie das Wachstum der Borrelienkultur mit Hilfe von Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie bei 200- bis 400-facher Vergrößerung. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, mischen Sie die Kultur mit einer serologischen Pipette oder verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Transferpipette, während Sie auf und ab pipettieren. Dann auf jeder Seite eines Hämozytometers zum Zählen in 10-Mikroliter-Kulturaliquot laden.
Als nächstes verdünnen Sie die Exponentialphasen-Borrelienkultur im Verhältnis eins zu zwei oder eins zu vier mit einem Medium in einem 1,7-Milliliter-Röhrchen. Berücksichtigen Sie bei der Bestimmung der Zellzahl den Verdünnungsfaktor entsprechend. Besprühen Sie die Oberflächen und das Hämozytometer nach Gebrauch mit 10 % verdünntem Bleichmittel und/oder 70 % Ethanol.
Für die Extraktion von DNA oder die Isolierung von Borrelienzellen wird die Exponentialphasenkultur 10 Minuten lang bei 4.000 G zentrifugiert und der Überstand in einem geeigneten biologisch gefährlichen Abfall entsorgt. Verarbeiten Sie die pelletierten Bakterien mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit oder resuspendieren Sie sie in einem geeigneten Medium für das beabsichtigte Experiment. Sterilisieren Sie am Ende jedes Experiments alle Geräte mit Ethanol und UV-Strahlung.
Sammeln Sie die flüssigen Abfälle, einschließlich der überschüssigen Kultur, in einer Abfallflasche und fügen Sie 10 % Bleichmittel hinzu. Stellen Sie die Flasche auf 80 Grad Celsius, bevor Sie sie entsorgen. Für die Langzeitlagerung von Borrelienkulturen entnehmen Sie das gewünschte Volumen einer Exponentialphasenkultur bei 10 bis 100 Millionen Zellen pro Milliliter, fügen Sie 10 % steriles Glycerin hinzu und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren.
Übertragen Sie 1,5 Milliliter Aliquots der Mischung in zwei Milliliter kryogene Fläschchen mit Schraubverschluss. Lagern Sie die Vorratsfläschchen bei 80 Grad Celsius. Halten Sie einen Vorrat mit mindestens 10 Tuben jeder Sorte im Gefrierschrank. Um Borrelien von harten Zecken zu kultivieren, sammeln Sie erwachsene Weibchen, Männchen und Nymphenzecken.
Sterilisieren Sie Zecken an der Oberfläche, indem Sie sie zwei Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen und in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen lassen. Anschließend werden die Zecken einzeln mit einem sterilen Skalpell in mehrere Stücke zerlegt. Geben Sie die Stücke dann in zwei Milliliter Röhrchen, die 1,5 Milliliter des mit Antibiotika angereicherten Mediums enthalten.
Inkubieren Sie die Kulturen bei 34 Grad Celsius und überprüfen Sie die ersten zwei Wochen zweimal wöchentlich und danach sechs Wochen lang zweimal wöchentlich mit Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie auf Spirochäten. Um Borrelien aus Blutproben zu kultivieren, entfernen Sie das Plasma vorsichtig aus dem Röhrchen und beimpfen Sie einen Milliliter Plasma in fünf Milliliter vorgewärmtes, modifiziertes Kelly-Pettenkofer- oder MKP-Complete-Medium. Für die Kultivierung von Borrelien aus einer Hautbiopsie sterilisieren Sie die Hautbiopsie oberflächlich mit 70%igem Ethanol und Wasserstoffperoxid.
Anschließend wird die Biopsieprobe in physiologische Kochsalzlösung gelegt. Würfeln Sie die Probe mit einer sterilen Rasierklinge in einer Glas-Petrischale in zwei bis sechs kleinere Stücke, während Sie sie in die physiologische Kochsalzlösung eintauchen. Die gewürfelte Probe und ein Milliliter Kochsalzlösung, in der die Hautbiopsie aufbewahrt wurde, werden in fünf Milliliter vorgewärmtes Medium mit Antibiotika überführt und bei 33 Grad Celsius inkubiert.
Für die Herstellung von Tellern erwärmen Sie 300 Milliliter 1,5x BSK oder MKP Complete Medium ohne Gelatine. Auch 200 Milliliter 1,7%Agarose auf 55 Grad Celsius erwärmen. Mischen Sie die Flüssigkeiten und pipettieren Sie jeweils 15 Milliliter auf 16 tiefe Petrischalen zur unteren Agarschicht.
Bewahren Sie den Rest des Mediums in einem Wasserbad auf. Quantifizieren Sie die Dichte der Borrelienkultur und verdünnen Sie sie in einem flüssigen Medium auf die gewünschte Dichte. Nachdem die Bodenplatten erstarrt sind, geben Sie 10 Milliliter der restlichen Agar-Mischung als oberen Agar in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Spirochäten.
Gießen Sie die Suspension auf die untere Agarplatte in die beschriftete Petrischale. Nachdem die Platten erstarrt sind, verschließen Sie sie und legen Sie sie kopfüber bei 34 bis 35 Grad Celsius in 2,5 % Kohlendioxid. Bei richtiger Zubereitung erschien das BSK-Medium rot-orange und klar.
Zum Vergleich ist hier auch das ungeimpfte MKP-Medium dargestellt. Die Überwucherung durch konkurrierende Bakterien führt zu Trübungen und verklumpten Materialien im Medium. Das Bakterienwachstum wurde mittels visueller Inspektion mittels Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie überwacht.
In der exponentiellen Phase sind Borrelienzellen typischerweise schlank, geknickt und bis zu einem gewissen Grad modal. Wenn die Kulturen in der stationären Phase eintreten, werden runde Körper immer deutlicher. Borrelienzellen sind anspruchsvoll und jede Spezies, jeder Stamm und sogar jedes Isolat unterscheidet sich sowohl genetisch als auch durch Anpassung an den Wirt, von dem sie isoliert wurden.
Bei der Herstellung von Nährmedien machen geeignete Zutaten einen enormen Unterschied in der Vitalität der Borrelienkultur oder sogar in der Lebensfähigkeit der Kultur. Borrelien-Spirochäten sind eine Herausforderung für die Kultur, aber Kultur ist möglich. Die Kultur im Labor ist das Sprungbrett für die Erforschung der Biologie dieser Bakterien.
Die Kultur liefert das Material, um das Genom, das Proteom, die Evolution und die Interaktionen der Borrelienarten mit den Wirtserregern zu verstehen. Die Borrelienkultur kann mehrere Wochen dauern, bis Spirochäten ausreichend vorhanden sind, um nachgewiesen zu werden. Dies schränkt Diagnoseanwendungen ein.
Aber die Kultur kann zeigen, ob Borrelienarten vorhanden, lebensfähig und sich vermehren, und sie kann den Zugang zu Behandlungen erleichtern.
