Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die Beteiligung eines bestimmten Faktors an der doppelten Befruchtung der Arabidopsis zu bewerten. Der Befruchtungsstatus kann anhand der Morphologie der Spermakerne auf einen Blick beurteilt werden, so dass die schnelle Erfassung der Daten für die statistische Auswertung möglich ist. Diese Methode ist spezifisch für die Bewertung für Befruchtung Phänotyp bei Arabidopsis.
Es gibt immer noch unbekannte Düngung Regulatoren, auch wenn in Arabidopsis. Diese Methode wäre nützlich für die funktionelle Analyse zukünftiger unbekannter Düngefaktoren. Um die Fähigkeit des schnellen und intakten Umgangs mit den Eizellen zu beherrschen, sind wichtige für den Erfolg dieser Analyse.
Zunächst wachsen Arabidopsis thaliana bei 22 Grad Celsius unter einem 16-stündigen Hellen und achtstündigen dunklen Zyklus in einer Wachstumskammer. Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Messen Sie zwei bis drei Wochen nach dem Abschneiden des ersten Stiels die Pflanzenhöhe.
Pflanzen mit einer Höhe von mehr als 25 Zentimetern gelten als kräftig wachsende Pflanzen und eignen sich zur Analyse. Um zu entleeren, suchen Sie nach Knospen in Stufe 11 mit Flecken von Blütenblättern an der Spitze gesehen. Verwenden Sie eine Nummer fünf Zangen, um Sepal, Blütenblatt und Stamen von Blütenknospen zu entfernen.
15 bis 18 Stunden nach der Entschämung, nehmen Sie das Stamen einer DMP9-Knockdown-Linie mit Hintergrund der HTR10-mRFP-Blume in Stufe 13, indem Sie das Filament mit Zangen kneifen. Um zu bestäuben, klopfen Sie das Stigma eines entstickten Stempels mehrmals mit einem dehiscent Anther. Sieben bis acht Stunden nach der Bestäubung, sammeln Sie den Stempel und legen Sie ihn auf das doppelseitige Band.
Drücken Sie dann vorsichtig mit Zangen, um den Stempel auf dem Band zu fixieren. Schneiden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die oberen und unteren Enden des Eierstocks mit einer Injektionsnadel ab. Bewegen Sie die Spitze der Injektionsnadel, um die Eierstockwand auf beiden Seiten des Replum aufzuschlitzen.
Schneiden Sie sorgfältig, um den Funiculus und den Sendetrakt nicht zu trennen. Evert die Eierstockwand. Kneifen Sie die Basis des Septums, mit dem Dieovuls verbunden sind, und heben Sie sie vorsichtig mit Zangen an.
Übertragen Sie die Eizellen in einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas, und decken Sie vorsichtig mit einem Deckglas zur Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Passen Sie die Objektivlinse auf ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Fluoreszenzfilterwürfel ausgestattet ist, auf 20x oder 40x. Erfassen Sie Bilder der Eizellen, die Spermienkerne enthalten, die mit mRFP gekennzeichnet sind.
Bestätigen Sie die Anzahl der mRFP-markierten Spermakerne in einem Embryosack. Bestätigen Sie die Form und Position jedes mRFP-markierten Spermakerns in einem Embryosack. In dieser Studie wurden Befruchtungsphänotypen durch Spermien-Kernsignalmorphologie in Ovule beurteilt.
Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle mikropylar Seite und zentrale Zelle Charazal Ende Seite. Dies deutet auf eine erfolgreiche Doppeldüngung hin. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensierten mRFP-markierten Spermakern am zentralen Zellkern sowie einen kondensierten mRFP-markierten Spermakern außerhalb der Eizelle enthielten, was auf eine einzelne Befruchtung hindeutet.
Bei einer fehlgeschlagenen Doppelbefruchtung wurden zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Grenze der Eizelle und der Zentralzelle beobachtet. In der Analyse mit DMP9-Knockdown-Linie mit Hintergrund von HTR10-mRFP Pollen wurden selten Ovules beobachtet, die einen einzelnen kondensierten mRFP-markierten Spermakern oder drei oder mehr mRFP-markierte Spermakerne enthielten. In Kombination mit der Verwendung weiblicher Markerlinien kann ein genauerer Düngestatus analysiert werden.
Zum Beispiel kann der Düngestatus nach der Gamete-Fusion und vor der Karyogamie beurteilt werden. Ja, der Düngeprozess ist in mehrere Schritte unterteilt. Die Fragen, an denen jeder Düngeregulator beteiligt ist, welche Schritte mit dieser verbesserten Methode beantwortet werden können.
Es würde tiefere Einblicke in die sexuelle Reproduktion der Pflanze geben.
