Die Autoren bedanken sich bei Michael Anderson für die Einrichtung in der Lee-Labor akzeptiert diese Methoden zur Untersuchung der Spermatogenese mit fachkundiger Beratung von Karen Hales danken. H. Oda und Y. Akiyama-Oda großzügig sofern die γ-Tubulin-GFP Fliegen Lager. Diese Arbeit wurde durch ein NIH R01 Zuschuss für LAL (GM074044) unterstützt.

1. Hoden Dissection <ol><li> Anesthetize Fliegen in einer Flasche oder einem Fläschchen mit einem Strom von CO 2 und übertragen, um eine Fliege Pad. </li><li> Sortieren fliegt unter einem Binokular mit einem kleinen Pinsel, und sammeln eine entsprechende Anzahl (je nach Experiment) von Drosophila Männchen der gewünschten Genotypen. Junge Männer (0-2 Tage alt) sind ideal für die Prüfung Zellen in den früheren Stadien der Spermatogenese (zB Spermatogonien, Spermatozyten und frühen postmeiotischen Spermatiden), während etwas ältere Männer (2-5 Tage alt) sind ideal für die Prüfung der Zellen in den letzten Stadien der Spermatogenese (insbesondere reifen Spermien). </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Flügel aus jeder fliegen zu entfernen (um die Fliegen aus variabel in Flüssigkeit während der Präparation zu verhindern). </li><li> Hinzufügen ~ 500 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) in einem Tropfen auf eine silikonbeschichtete Dissektion Schale aufein schwarzer Hintergrund. Andere wässrige Lösungen wurden erfolgreich Hoden Präparation 3 verwendet. </li><li> Punkt in Richtung der vorderen Zange der Fliege, fassen Sie es durch den Brustkorb, und tauchen es in der PBS-Tropfen. Während Sie durch das Binokular, verwenden Sie eine andere Pinzette zu greifen und ziehen Sie den äußeren Genitalien (dunkelbraun Struktur am hinteren Ende des ventralen Bauch gelegen) hinten, bis es aus dem Bauch löst. In den meisten Fällen werden die Hoden, Samenblasen und Zubehör-Drüse aus dem Bauch zusammen mit der äußeren Genitalien entfernt werden, wenn nicht, kann eine einzelne Pinzette in den Bauch und necken sich die Hoden. </li><li> Separate Hoden aus dem Zubehördrüse und äußeren Genitalien mit zwei Pinzetten in der PBS-Tropfen (Abbildung 2). Wildtyp-Hoden werden leicht von benachbarten weißen Gewebe durch ihre gelbe Farbe aus. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 über. </li><li> Um Hoden von Männern pharate (i isolieren.. E innerhalb der Puppenhülle eingeschlossen), ist ein weiterer Schritt zuerst durchgeführt, die das Entfernen der Fliege aus der Puppenhülle umfasst werden, dieser Schritt wurde bereits an anderer Stelle 31 beschrieben. Fahren Sie mit der Präparation wie bei den Erwachsenen Hoden ab Schritt 1.2. </li><li> Um Hoden von männlichen Larven zu isolieren, führen Sie eine Modifikation eines Protokolls zur Isolierung von Drosophila-Larven 32 Eierstöcke. Kurz gesagt, können männliche Larven von weiblichen Larven durch die Anwesenheit von einem Paar große, klare, ovale Strukturen (Larven Hoden) im hinteren Drittel der Fettkörper eingebettet unterschieden werden. Um Larven Hoden isolieren, teilweise die Haut abziehen öffnen die männliche Larve, die Hoden und die umgebende Fettkörper aus dem Bauch zu isolieren, wie für die Isolierung der Larven Eierstöcke beschrieben. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 von dem hier beschriebenen Protokoll, die Hoden können später von der fetten Körper nur vor der Montage (Schritte 2.3 oder 3.14) als für den Eierstöcken 32 beschrieben, entfernt werden. </li></ol><ol><li> Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig platzieren 2-3 Paar Hoden in einem Tropfen 5.4 ml PBS auf einem quadratischen Deckglas. Beachten Sie, dass das Verhältnis der Hoden Nummer PBS Lautstärke kann angepasst werden müssen: zu viel Flüssigkeit aus Zellen richtig Ausbreitung zu verhindern, wenn gequetscht, während zu wenig Flüssigkeit führt zu Zellen platzen, wenn gequetscht. Optional: Verwenden silikonisierte Deckgläser, um die Einhaltung von Gewebe zu minimieren, um den Schlupf in Schritt 3.2 zu decken. </li><li> Verwenden Sie eine Zange, um jeden Hoden offen an einer geeigneten Stelle zu reißen, um das Vorhandensein der gewünschten Keimbahn-Zelltypen in der Vorbereitung zu maximieren (beachten Sie, dass der Inhalt des Hodens wird meist Austritt aus dem zerrissenen Region auf den Objektträger während der Quetschung Schritt aus.) Um Spermatogonien und Spermatozyten zu bereichern, aufreißen die Hoden neben seinem apikalen Spitze (Ebene 1, 2B). Um Spermatozyten und Spermatiden bereichern, Tränen öffnen Sie die Hoden bei einer posITION leicht basalen auf Stufe 1 (Ebene 2, 2B). Um reifer Keimbahnzellen zu bereichern, reißen die Hoden näher an offen, wo die Krümmung beginnt (Stufe 3, Abbildung 2B). </li><li> Sanft statt einen Glasobjektträger über das Deckglas, um die Hoden quetschen, nicht Druck manuell anwenden, wie das Gewicht des Deckglases allein ist ausreichend, um eine richtig gequetscht Probe zu erhalten. Versuchen Sie zu vermeiden Luftblasen. Optional: Verwenden Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um die Einhaltung des Gewebes zu fördern, um in Schritt 3.2 gleiten. </li><li> Verwenden Vorbereitung sofort (idealerweise innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung), um lebende Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie beobachten, für transgenen Fliegen mit der Expression von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in den Hoden, können lebende Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie in diesem Schritt untersucht werden. Alternativ fahren Sie mit der Fixierung und Antikörperfärbung (Protokoll 3). </li><li> Docht vorsichtig überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas mit einer Reinigungs wipe zu Abflachung der Vorbereitung zu ermöglichen, bis die Keimzellen sind deutlich im Fokus. </li></ol> 3. Formaldehyd-Fixierung und Antikörperfärbung <ol><li> Schnellfrost jede Folie mit Hoden gequetscht (von Protokoll Nr. 2) mit einem Paar Metallzange, um es kurz in flüssigen Stickstoff tauchen (bis flüssigem Stickstoff stoppt Blasenbildung). </li><li> Entfernen Sie das Deckglas sofort mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Metallzange, um Folien in eine vorgekühlte Glasobjektträger mit eiskaltem 95% Ethanol gefüllt (spektrophotometrische grade, Methanol-frei) zu übertragen. Lagerung bei -20 ° C für 10 min. </li><li> Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger-Rack mit 4% Formaldehyd in PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T) gefüllt übertragen. Lagern bei Raumtemperatur für 7 min. </li><li> Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger mit PBS gefüllten Rack übertragen. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen 1x. Führen Sie alle Waschungen durch Verwerfen Lösung in der Glasobjektträgergestell ( <em&gt; Dh. durch Gießen out) und Ersetzen durch frische Lösung. </li><li> Verwerfen die PBS und tauchen Folien in PBS-T für 30 min bei Raumtemperatur, Zellmembranen durchlässig zu machen. </li><li> Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen. </li><li> Blockierungsschritt (optional): Tauchen Folien in PBS plus 1% BSA für 45 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift einen Kreis auf der Folie herum gequetscht Gewebe (mit dem Auge gut sichtbar), um die Antikörperlösungen (in Schritten 3.9 und 3.11 hinzugefügt) beschränken zu ziehen. Das Gewebe sollte feucht zu allen Zeiten während der Durchführung Immunfärbung gehalten werden. </li><li> Hinzufügen 30-40 ml primärem Antikörper (in PBS-T, 1:400 bis 1:50 verdünnt, je Antikörper), um Gewebe innerhalb des Kreises. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, verdünnte primäre Antikörper in PBS-T plus 1% BSA. Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper (für die Färbung von Zentrosomen in Fig. 4) wurde 1:100 verdünnt. Inkubation in einer feuchten, dunklen Kammer (z. B. geschlossene Kunststoff-Box.mit feuchten Papiertüchern) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur 3x. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, zweimal waschen in PBS-T und einmal in PBS (5 min bei Raumtemperatur jeweils). </li><li> Hinzufügen 30-40 ml Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt 1:400 in PBS) auf das Gewebe und Inkubieren im Dunkeln für 1-2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen. </li><li> Hinzufügen 30-40 ml DAPI-Lösung (0,2 mg / ml in PBS) zu dem Gewebe innerhalb des Kreises. </li><li> Sanft statt ein Deckglas über das Gewebe, kümmert sich um Luftblasen zu vermeiden. Wenn Luftblasen erscheinen soll, sorgfältig um das Deckglas zu bewegen, ohne die Squash bis die Blasen von den Seiten des Deckglases zu entkommen. </li><li> Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um überschüssige DAPI von den Rändern der Folie tupfen. </li><li> Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack. </li><li> Mit dieser Vorbereitunginnerhalb der nächsten 3-4 h auf immungefärbten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. Für längerfristige Speicherung von Dias (bis mindestens mehrere Wochen), verwenden Sie eine Glycerin-basierte Festmontage Medien mit DAPI und speichern Objektträger bei -20 ˚ C </li><li> Alternativ fixieren Proben in Methanol anstelle von Formaldehyd (je nach Antigen). Nach Abschluss der gesamten Protokoll über den Schritt 3.2, tauchen Dias von gequetschten Hoden in Methanol für 10 min bei -20 ° C und fahren Sie mit Schritt 3.5 weiter. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes.">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li><li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis.">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Obwohl die Hoden von Wildtyp-Fliegen können ohne weiteres durch ihre gelbe Farbe (im Gegensatz die benachbarten weißen Gewebe) identifiziert werden kann, sind die Hoden von weißen mutierten Fliegen weiß und kann daher gelegentlich mit dem Darm zu verwechseln. Die meisten transgenen Linien, die typischerweise in einem weißen Hintergrund, haben auch weiße Hoden, weil die Mini-white-Gen in P-Elementen funktioniert Pigmentakkumulation in den Hoden nicht fördern. Bei Drosophila<...

Drosophila Hoden sind eine ideale Modellsystem für die Untersuchung von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Regulation von Stammzellen, Meiose und Samenentwicklung 13-18. Die Spermatozyten und ihre Reife Spindeln sind groß und damit praktisch für die zytologische Analyse und entspannt Zellzyklus-Kontrollpunkte während der Spermatogenese erleichtern die Untersuchung von Mutationen in Zellzyklus-Genen. Verschiedene Zelltypen können in geordneten Ablauf entlang der Länge der Hoden beobachtet werden, und jede Störung der Spermatogenese zu Änderungen in dieser Gesamtanordnung führen. Diese Eigenschaften kombiniert mit Drosophila genetische Werkzeuge haben die Mutationsanalyse der Spermatogenese 21-23 erleichtert. Die Stadien der Drosophila Spermatogenese haben gut definiert. Keimbahnzellen, die synchron in Zysten Fortschritte sequentiell durch die Stadien der Spermatogenese entlang der Länge des Hodens. Während boten der mitotischen und meiotischen Teilungen der männlichen Keimzellen, tritt Zytokinese unvollständig, so dass die Tochterzellen bleiben zytoplasmatische Brücken Ringkanäle bekannt sind (Abbildung 1). Die apikale Spitze des Hodens enthält eine Bevölkerung von Keimbahn-Stammzellen, die Anlass zu den Spermatogonien, die vier mitotische Teilungen mit unvollständiger Zytokinese unterziehen, um 16-Zellen-Zysten primären Spermatozyten generieren. Nach premeiotic S-Phase, primären Spermatozyten geben G2, eine längere Wachstumsperiode von ~ 90 Stunden, während der zellulären Volumensteigerungen ~ 25-fache. Progression durch Meiose I und Meiose II führt zur Bildung von 32-Zell-Zysten sekundären Spermatozyten und 64-Zellen-Zysten von haploiden Spermatiden sind. Die unreifen, runden Spermatiden in umfangreichen zellulären Umbau zu reifen Spermien bilden. Post-meiotischen Zellen, insbesondere die Bündel der Verlängerung und reife Spermatiden, besetzen viel von dem Volumen der Hoden. Ter erfolgreich den Transport von Funktions Spermien weibliche Fliegen erfordert die Koordination zwischen den verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystem, das aus mehreren gekoppelten Strukturen (die Hoden, Samenblasen und akzessorischen Drüsen) und einem Einzel Ejakulationsleitung zusammengesetzt ist (Abbildung 2). Spermien werden in den Hoden produziert und innerhalb der Samenbläschen, bis Kopulation 24 gespeichert. Die Zubehör sekretorischen Drüsen enthalten Zellen, die Samenflüssigkeit zu produzieren. Die Spermien Migration aus den Samenbläschen mit Samenflüssigkeit innerhalb des Ejakulationsleitung, die sowohl für die Samenbläschen und die Anhangsdrüsen verbunden ist gemischt. Diese Mischung von Spermien und Samenflüssigkeit wird schließlich aus dem männlichen in die Vagina der weiblichen Fliegen durch die Ejakulation Lampe am hinteren Ende des männlichen Bauch 25 angeordnet gepumpt. Proteine ​​in der Samenflüssigkeit sind für eine längere Lagerung von Spermien in spezialisierten Organen wie Spermatheken in der rep bekanntroductive Trakt von Drosophila-Weibchen 26. Ausgezeichnete Methoden zur Isolierung von Drosophila Hoden und Visualisierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese sind in der wissenschaftlichen Literatur 3-12 erhältlich. Wir hier in diesem Körper von Wissen hinzufügen, indem Beispiele für diese Protokolle mit einem begleitenden Video-Demonstration. Das Protokoll für die Herstellung von Lebendproben Hoden zur Phasenkontrastmikroskopie auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis 27. Das Protokoll für die Formaldehyd-Fixierung und Immunfärbung von Hoden wird auch auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis 28. Die hier beschriebenen Ansätze wurden in vielen Studien von Drosophila Spermatogenese verwendet (zum Beispiel die Rollen von Dynein beurteilen, ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motor während der Drosophila Spermatogenese). Zusätzlich zu den grundlegenden Protokolle werden Vorschläge für varyin bereitgestelltg der Dissektion, um für Spermatogonien, Spermatozyten, oder reifen Spermien zu bereichern. Verschiedene Verfahren zum Verarbeiten der Hoden, so daß Zysten entweder erhalten bleiben oder zerstört werden, wie nötig sind, beschrieben. Ein Vorteil bei der Verwendung Hoden Drosophila als Modellsystem ist, dass, im Vergleich zu Drosophila Eizellen und Embryonen, Antikörper und Farbstoffe können leicht eindringen Zellen nach ihrer Streuung aus den Hoden und weniger Waschschritte erforderlich sind, so können Protokolle in einer relativ durchgeführt werden kurze Zeit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:351px;">Sylgard</td>
			<td style="width:215px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:127px;">SYLG184</td>
			<td style="width:321px;">Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PAP pen</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">NC9888126</td>
			<td style="width:321px;">Ted Pella #22309</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Clear nail protector</td>
			<td style="width:215px;">Wet n Wild</td>
			<td style="width:127px;">7780235001</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:215px;">Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6557</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-003</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">BP151-100</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">AC61511-0040</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Methanol</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">A412-4</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">16% Formaldehyde</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">28908</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:351px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">SL2</td>
			<td style="width:321px;">Use according to manufacturer&#39;s directions to siliconize cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DAPI</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D-9542</td>
			<td style="width:321px;">0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:215px;">Research Products International Corp.</td>
			<td style="width:127px;">S23020</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">S9763</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">S0751</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes delicate task wipers</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:351px;">BSA</td>
			<td style="width:215px;">Research Products International Corp.</td>
			<td style="width:127px;">A30075</td>
			<td style="width:321px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Glass Coplin staining jar, screw cap</td>
			<td style="width:215px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70315</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Single frosted microscope slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75X25</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>22247-1</td>
			<td style="width:321px;">Optional (to replace untreated microscope slides )</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Square cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:127px;">2865-22</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Razor blades</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">12-640</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimax Petri dish</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">S31473</td>
			<td style="width:321px;">Kimble #23060 10015 EMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>52100-51S</td>
			<td>Pattern 5 INOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Stemi 2000-CS stereoscope</td>
			<td style="width:215px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eclipse 80i</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Plan-Fluor 40x objective</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Axiophot</td>
			<td style="width:215px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Plan-Neofluar Ph2 40x objective</td>
			<td style="width:215px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem, das in großem Umfang verwendet wurde, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen aufzuklären. Beispielsweise haben Studien sowohl der männlichen und weiblichen Keimlinien Drosophila zur derzeitigen Verständnis der Meiose und Stammzellenbiologie beigetragen. Ausgezeichnete Protokolle sind in der Literatur für die Isolierung und Darstellung von Drosophila Ovarien und Hoden 3-12 erhältlich. Hierin sind Verfahren für die Präparation und Herstellung von Drosophila Hoden für die mikroskopische Analyse mit einem zugehörigen Video-Demonstration beschrieben. Ein Protokoll für die Isolierung Hoden aus dem Bauch von erwachsenen Männern und Herstellung von Folien lebendes Gewebe zur Analyse durch Phasenkontrastmikroskopie als auch ein Protokoll für die Befestigung und die Immunfärbung Hoden für die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Diese Techniken können bei der Charakterisierung von Drosophila-Mutanten, d aufweisen angewendetefects der Spermatogenese sowie der Visualisierung der subzellulären Lokalisation von Proteinen.

Ein Beispiel eines gut präpariert Paar von Drosophila männlichen Geschlechtsorgane ist in 2A gezeigt. Hoden aus dem Abdomen der erwachsenen männlichen Fliege entfernt werden typischerweise zum Ejakulationsleitung (braun, 2A &#39;) und einem Paar Anhangsdrüsen (grün, 2A&#39;) über ein Paar von Samenblasen (blau, 2A &#39;) befestigt . Die Hoden von den meisten zugehörigen somatischen Gewebe, das Ejakulationsleitung und die Anhangsdrüsen t...

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Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

25.9K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center.  Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben. 

Serie: Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Forschung

Biologie

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...