Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um Lebensmittelproben auf die verschiedenen C-Perfringentoxintypen zu testen. Wir interessieren uns besonders für die Prävalenz der Toxinotypen B und D, die das Epsilontoxin produzieren. Unser Protokoll ermöglicht eine einfache Anreicherung und Detektion der verschiedenen C-Perfringen-Toxinotypen ohne den Einsatz von anaeroben Kammern oder Inkubatoren mit begrenzter Unterkultivierung.
Diese Methode könnte auch verwendet werden, um Boden, Wasser, Fäkalienproben und mehr zu testen. Demonstriert wird das Verfahren von Zuha Anwar und Samantha Regan, Technikerinnen und Technikern aus dem Labor. Beginnen Sie mit dem Vorbereiten von modifizierten schnell perfringens medium oder RPM.
Kombinieren Sie Zutaten nach Manuskriptrichtungen, und autoklavieren Sie die Mischung bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Lassen Sie das Medium auf ca. 40 Grad Celsius abkühlen und fügen Sie dann D-Cycloserin zu einer Endkonzentration von 440 Milligramm pro Liter hinzu. Die Drehzahl auf 15 Milliliter konische Röhren aseptisch übertragen und bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius lagern.
Vor der Verwendung, erwärmen Sie das Medium auf 37 Grad Celsius. Übertragen Sie das Lebensmittel bei der Entnahme von zu prüfenden Proben gemäß den Manuskriptanweisungen ins Labor. Wenn das Essen nicht sofort getestet wird, kann es bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.
Notieren Sie sich die Art der Lebensmittel und das Herkunftsland sowie alle anderen relevanten Informationen. Um das Essen zu testen, transferieren Sie etwa ein bis zwei Gramm auf eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie es fein mit einer sterilen Rasierklinge oder skalpell. Impfen Sie es in 10 Milliliter PBS in einem 15 Milliliter konischen Rohr, und gut mischen.
Wählen Sie für vegetative Zellen, indem Sie fünf Milliliter der PBS-Lebensmittelmischung in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Milliliter RPM übertragen und den Deckel fest schließen. Wählen Sie für Sporen, indem Sie die restlichen fünf Milliliter der Mischung für 15 Minuten auf 85 Grad Celsius erhitzen. Und dann übertragen Sie es auf ein Rohr mit Drehzahl und schließen Sie den Deckel fest.
Um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten, Wirbel und invertieren die Lebensmittel RPM Kulturen. Dann die konischen Rohre fest versiegeln und die Deckel mit Paraffinfolie umwickeln, um eine anaerobe Umgebung zu schaffen. Inkubieren Sie die Rohre über Nacht bei 37 Grad Celsius und notieren Sie trübe oder Gärung am nächsten Morgen.
Bereiten Sie Tryptose Sulfite Cycloserine oder TSC Agar entsprechend der Herstellerrichtung vor und verwenden Sie dann die Sandwich-Technik, um sie mit Übernacht-RPM-Kulturen zu impfen. Bereiten Sie die Grundschicht der Platten vor, indem Sie 10 Milliliter des geschmolzenen Agar auf sterile Petrie-Schalen übertragen und es erstarren lassen. Halten Sie den verbleibenden TSC Agar bei 40 Grad Celsius für die oberste Schicht und übertragen Sie sorgfältig 100 Mikroliter der Übernacht-RPM-Kultur auf die Agar-Basis.
Einige Kulturen können durch fermentation unter Druck stehen, also achten Sie darauf, alle geeigneten persönlichen Schutzausrüstungen zu tragen. Das Inokulinmitische mit sterilen Glasperlen oder einem Zellstreuer verteilen und RPM fünf bis zehn Minuten in den Agar aufnehmen lassen. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um 20 Milliliter des geschmolzenen TSC Agar sorgfältig auf die Platte zu übertragen.
Ersetzen Sie den Petrie Tellerdeckel und lassen Sie TSC Agar bei Raumtemperatur vollständig erstarren, dann die Schale invertieren und bei 37 Grad Celsius über Nacht inkubieren. Führen Sie bei Bedarf serielle Verdünnungen der RPM-Kultur vor der Impfung in TSC Agar durch. Nach der Inkubation, untersuchen Platten auf bakterielles Wachstum.
Aerobe Bakterien können an der Oberfläche des Agar vorhanden sein, während anaerobe Bakterien in den Agar eingebettet werden. Sulfit reduzierende Bakterien werden den umgebenden Agar schwarz machen, und mögliche C-Perfringens-Kolonien werden schwarz und in den Agar eingebettet sein. Wenn es eine dichte Menge an aeroben bakteriellen Wachstum auf der Oberfläche der Platte, verwenden Sie einen Zellschaber, um Kolonien aus ausgewählten Bereichen zu entfernen.
Verwenden Sie einen sterilen Einweg-Augentropfen, um die vermuteten C-Perfringen-Kolonien aus dem Agar zu pflücken und sicherzustellen, dass die Luft vor dem Durchstechen des Agars vertreibt wird. Übertragen Sie die Kolonien auf 10 Milliliter frische RPM in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Mehrere Kolonien könnten von derselben Platte in separate Drehzahlkulturen abgetastet werden.
Die konischen Rohrdeckel fest befestigen, in Paraffinfolie wickeln und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. C perfringens ist ein BSL-Organismus. Es ist wichtig, jederzeit angemessene Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, insbesondere beim Öffnen von Drehzahlkulturen über Nacht, und gebrauchte Medien sorgfältig zu dekontaminieren und zu entsorgen.
Entfernen Sie am nächsten Tag die Nachtkulturen und untersuchen Sie sie auf Trübung und Fermentation, und fahren Sie dann mit der DNA-Extraktion fort. Um sanft die RPM-Kultur umzukehren, um alle besiedelten Bakterien zu zerstreuen und die Röhre vorsichtig zu öffnen. Übertragen Sie einen Milliliter auf ein Mikrozentrifugenrohr und pellet die Bakterien durch Zentrifugation.
Waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter sterilem PBS. Wenn sich unverdaute Gelatine auf den Bakterien niedergelassen hat, fluffen Sie sie ab, indem Sie sich mit PBS aufregen. Die Gelatine und PBS vorsichtig ansaugen und das verbleibende bakterielle Pellet mit einem Milliliter frischer PBS wieder aufhängen.
Es ist wichtig, jede pelletierte Gelatine mit begrenzter Störung des Zellpellets zu entfernen. Wenn Gelatine nicht entfernt wird, kann dies die DNA-Extraktion und PCR hemmen. Zentrifugieren Sie die Bakterien für 10 Minuten und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand.
Führen Sie dann die DNA-Extraktion mit einem Kit durch, das speziell für grampositive Bakterien entwickelt wurde. Verwenden Sie die DNA sofort oder speichern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie PCR auf der extrahierten DNA durch, um festzustellen, ob die Kulturen für C-Perfringentoxinotypen positiv sind.
Verwenden Sie C perfringens DNA als positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien funktionieren. Führen Sie die PCR nach Manuskriptanweisungen aus und analysieren Sie die Produkte mit Agarose-Gel-Elektrophorese. Dieses Protokoll wurde verwendet, um insgesamt 216 Lebensmittelproben zu testen, die in New Yorker Einzelhandelsgeschäften gekauft wurden.
Die Proben enthielten verschiedene Fleischproben, Geflügelproben und Fischproben. C perfringens Typ B wurde als Positivkontrolle verwendet. Es wurde festgestellt, dass 15 bis 20 % der in die Stichprobe einbezogenen Lebensmittel positiv auf C-Perfringen getestet wurden.
Von den 34 positiven Proben enthielten 31 Proben das Alphatoxin, eine Probe das Alpha-, Beta- und Epsilontoxin. Und zwei Proben enthielten das Alpha- und Epsilontoxin. Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um Lebensmittelproben auf die verschiedenen C-Perfringentoxintypen zu testen.
Wir interessieren uns besonders für die Prävalenz der Toxinotypen B und D, die das Epsilontoxin produzieren.
