Dank Michaela Hall, Larissa Bispo und Gustavo Tavares für technische Hilfe.

Lebensmittel, die roh gegessen werden oder leicht gekocht sind die größten Bedenken für die menschliche Gesundheit. Beispiele hierfür sind Salat Gemüse, Obst, Schalen- und Krustentieren. 1. Probenentnahme <ol><li> Die Proben werden unter Bedingungen, die Kontamination zu minimieren, und in getrennte, saubere Säcke beim Transport gespeichert. Sobald sie aufgenommen sind, sind die Proben bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden. </li></ol> 2. Enriched Kultur Vorbereitung <ol><li> Obst und Gemüse: <ol><li> Zeigen ca. 10 g Material in einem haltbaren Kunststoffbeutel. Wenn Verarbeitung größerer Material, konzentrieren sich auf die Haut der Frucht oder Gemüse. 90 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Verfahren in einem Schaufelmischer für 30 Sekunden. Alternativ kann das Material von Hand bewegt werden, wenn eine Blattmischer ist nicht verfügbar. </li><li> Sammeln Sie die Flüssigkeit in zwei 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifugenröhrchen bei 4000 × g für 7 min zu Pellets Bakterien. </li&gt; <li> In 30 ml sterile Luria Bertani (LB) Brühe Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren die pelletierten Bakterien. </li><li> Inkubieren auf einem Schüttler O / N, hält eine Röhre bei 25 ° C und die andere bei 37 ° C. Die Kulturen sollten bei 200 Schwingungen pro Minute (OPM) geschüttelt werden. Speicher-Kulturen bei 4ºC bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Meeresfrüchte: <ol><li> Sezieren den Magen (Austern) oder Verdauungstrakt (Garnelen) mit einer sterilen Pinzette und Pinzette und in einen sterilen 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0. Mazeration der Probe um ein Homogenat zu erstellen. </li><li> Verzichtet werden 5 ml LB-Brühe in zwei sterile 5 ml Röhrchen und impfen jeweils mit der Meeresfrüchte Homogenat. </li><li> Inkubieren auf einem Schüttler O / N, hält eine Röhre bei 25 ° C und die andere 37 ° C. Die Kulturen sollten bei 200 opm geschüttelt werden. Speicher-Kulturen bei 4ºC bis zur Verwendung. </li></ol></li></ol> 3. Screening Kulturen für Integrons <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Hinweis: Standard-PCR-Protokolle werden in dieser Methode verwendet wird, unter Verwendung von Puffern mit dem Enzym zugeführt wird, und eine abschließende MgCl 2 -Konzentration von 2,5 mM. Falls erforderlich, hat Lorenz (2011) 24 PCR-Optimierung und Methoden zur Problembehandlung in einer früheren Ausgabe dieser Zeitschrift beschrieben. <ol><li> Gekochte DNA-Präparation: <ol><li> Dispense 100 ul angereicherten Kultur in ein steriles 0,5 ml PCR-Röhrchen. Erhitzen Sie die Probe auf 99 ° C für 10 Minuten, mit einem Wasserbad oder Wärmeblock. Snap Chill auf Eis für 2 min. </li><li> Mikrozentrifuge bei 14.000 × g für 5 min, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Zurück zu Eis. DNA-Proben können bei -20 ° C eingefroren werden, bis sie benötigt wurden, sondern muss auf Eis aufgetaut werden. </li></ol></li><li> Screening für Klasse 1 Integrons mittels PCR: ANMERKUNG: Mischkulturen aus dem O / N Inkubation für Klasse 1 Integrons Verwendung des HS463a / HS464-PCR-Protokoll (Tabelle 1) untersucht. <ol><li> Auftauen alle PCR-Reagenzien auf Eis, weg von jeder potenzielle souRCEs kontaminierender DNA. Make-up 48 &amp; mgr; l PCR Mastermix pro Probe, einschließlich Negativkontrollen (Tabelle 2). Verzichtet werden 48 ul der PCR-Master-Mix zu jedem Röhrchen mit Barrierespitzen. </li><li> In 2 ul DNA aufgetaut, um einzelne PCR-Gefäße mit Barriere-Tipps. Führen entsprechende Programm in der PCR-Thermocycler. </li><li> Um die Ergebnisse der Verstärkung zu bewerten, Elektrophorese 7 ul des PCR-Produkts auf einem 2% Agarosegel gegossen und in TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) durchgeführt. Gehören ein Molekulargewichtsmarker, wie beispielsweise ein 100 bp Leiter. </li><li> Beitrag färben das Gel mit einem DNA-Färbung, und visualisieren mit einem UV-Transilluminator. Überprüfen Sie, hat es keine Verstärkung in der negativen Kontrolle. Eine starke Bande bei etwa 470 bp für eine bestimmte Probe zeigt, dass die Mischkultur enthält Bakterien, die eine Klasse 1 Integron tragen. Reine Kolonien werden nun von einem beliebigen Mischkultur, die einen positiven PCR zurück isoliert werden. </li></ol></li></ol><ol><li> Reihenverdünnungen und Verbreitung Platten: ANMERKUNG: Um einzelne Kolonien aus den PCR-positiven Mischkulturen zu isolieren, wird der Mischkultur seriell 10-fach verdünnt in Natriumphosphatpuffer und ausplattiert, um einzelne Kolonien zu gewinnen dann. <ol><li> 1 ml der Mischkultur zu 9 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Mischen durch Umdrehen. 1 ml der Verdünnung auf eine weitere 9 ml Phosphatpuffer, und wiederholen, bis eine serielle Verdünnung von 10 -8 erreicht ist. </li><li> Striches 100 ul der 10 -4 bis 10 -8 Verdünnungen auf LB Agar, doppelt vorhanden. Die Platten O / N Inkubieren bei der gleichen Temperatur für die anfängliche Mischkultur verwendet wird. Die Platten können dann bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden, jedoch ist es am besten, um die einzelnen Kolonien ziemlich umgehend bearbeiten. </li></ol></li><li> Einzelkolonie Auswahl und gekochten DNA-Präparation: <ol><li> Wählen Sie einzelne Kolonien aus den Verdünnungsplatten, selecting so viele verschiedene Kolonietypen wie möglich, anhand von Kriterien wie Koloniegröße, Form und Farbe. Verwenden sterilen Zahnstochern zu Einzelkolonien aus der Verbreitung Platte auswählen. </li><li> Tippen Sie auf die Zahnstocher in die Kolonie, und dann in ein PCR-Röhrchen, das 100 &amp; mgr; l sterilem Wasser zu übertragen. Wenn eine große Anzahl von Kolonien zu sehen sein, dann können Kolonien in einer Mikrotiterplatte hergestellt werden. Drehen Sie die Zahnstocher zwischen den Fingern, um einige der Zellen in das Wasser zu entfernen. </li><li> Mit der gleichen Zahnstocher, impfen eine LB-Platte mit einem Streifen von der Kolonie. Eine große Zahl von Kolonien auf markierten Platten gespeichert werden, wenn jeder Streifen etwa 1 cm lang. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3, bis Sie eine geeignete Anzahl von Isolaten ausgewählt haben. </li><li> Inkubieren LB Platten O / N, bei der gleichen Temperatur wie bei der anfänglichen Anreicherungskultur verwendet. Kulturen können dann bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Zur Herstellung von DNA aus den Bakteriensuspensionen, gehen Sie wie ouin Abschnitt 3.1 tlined. Für das Screening von Reinkultur Lysaten, führen Sie die HS463a / HS464 PCR, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben. Isolate, dass eine positive Rück PCR wird zur Herstellung von genomischer DNA (Abschnitt 5) verwendet werden, und für weitere Analysen. </li></ol></li></ol> 5. Die genomische DNA Extraktion von Integron-positive Einzelkolonien Mit Bead Beating 25 <ol><li> Impfen 5 ml LB-Brühe mit einer Probe der Reinkultur isoliert in Abschnitt 4.2. Inkubieren O / N, bei gleicher Temperatur, die für die anfängliche Anreicherungskultur verwendet wurde Schütteln. </li><li> Pellet-Zellen bei 4.000 g für 7 min, dann entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 1 ml CLS-TC-Lösung in einem Lysismatrix E schnell prep Rohr. Mit einer Perlmühle Mahlmaschine, verarbeiten die Probe bei 5,5 m / s für 30 s. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 14000 × g für 5 min und Wiederherstellen 700 ul Überstand in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 700 ul Bindematrix verdünnt 1: 5 mit 6 M guanidinium Thiocyanat und mischen bei RT 5 min. Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min, Überstand verwerfen. </li><li> Zugabe von 800 ul Ethanolwaschsalz (70% Ethanol, 0,1 M Natriumacetat), vortexen, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Waschen für 5 min bei RT, Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min und Überstand verwerfen. Stellen Sie sicher, alle Überstand entfernt worden ist, mit einer Mikropipette bei Bedarf dann an der Luft trocknen lassen für 5 Minuten. </li><li> Das Pellet in 200 &amp; mgr; l Matrix TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) durch Auf- und Abpipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Zentrifuge bei 14.000 × g für 3 min und Transfer 160 ul der eluierten DNA in einem sterilen Röhrchen. Führen Sie einen aliquoten Teil der genomischen DNA-Extraktion auf einem 2% w / v Agarosegel, um die Ausbeute und die Integrität der DNA-Extraktion zu überprüfen. Die gereinigte genomische DNA wird bei -20 ° C gelagert und auf Eis aufgetaut, wenn für die PCR-Tests erforderlich. </li></ol> 6. Diagnostische PCR und DNA-Sequenzierung HINWEIS: Derin Abschnitt 5 hergestellte genomische DNA wird für alle diagnostischen PCR verwendet werden, und um den positiven Test für Klasse 1 Integrons bestätigen. <ol><li> Auftauen genomischer DNA auf Eis, die DNA-Probe und Impuls Spin Vortexen bei 14.000 · g für 20 sec. Wiederholen Sie die PCR für die Klasse 1 Integron-Integrase-Gens unter Verwendung HS463a / HS464 (Tabelle 1), was bestätigt, dass das Isolat positiv für das 471 bp Amplikon (Abschnitt 3.2). </li><li> Identifizierung positiver Kulturen zur Art wird durch Analyse des kleinen rRNA-Untereinheit-Gens (16S rDNA) erreicht. Verstärken die 16S-Gens unter Verwendung von Primern F27 / r1492 (Tabelle 1). Überprüfen Sie die PCR-Produkte mit Hilfe der Elektrophorese. Alle bakterielle Ziele sollten einen 16S Amplikon von etwa 1450 bp zu erzeugen. </li><li> Sequenz des 16S-rRNA-Gen-Amplikons zu Spezies Identität zu bestimmen, da es jedoch wahrscheinlich mehrere positive PCRs aus Stufe 6.2 werden, und viele von diesen werden die gleichen positiven bakteriellen Spezies, werden wir zuerst unterscheiden verschiedene Arten using Restriktionsverdau der 16S-PCR-Produkt. <ol><li> Verdauen ein Aliquot der PCR-16S mit dem Restriktionsenzym Hinf 1. Jedes Enzym, das erkennt 4 bp Spaltstellen werden zu tun, aber Hinf 1 erzeugt gute Vielfalt von 16S-Ziele, und ist eine zuverlässige, kostengünstige Enzym. </li></ol></li><li> Bis 30 &amp; mgr; l Restriktionsmengen verdauen Mastermix (Tabelle 2) in einem sterilen Röhrchen und fügen Sie 20 ul un-purfied 16S-PCR-Produkt. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad O / N. Überprüfen des Digests auf einem 2% Agarosegel. </li><li> Ergebnis der von Hinf 1 hergestellt Verdauung Mustern. Isolate mit derselben 16S Restriktionsprofil sind wahrscheinlich die gleichen Spezies. Anstatt Sequenzierung jedes 16S PCR-Produkt, Sequenz höchstens drei Vertretern jeder Hinf 1 Restriktionsmuster. </li><li> Aufreinigung der 16S-PCR-Produkte unter Verwendung eines kommerziellen Kits. Ein Einzelstrang-Exonuklease-Kit kann verwendet werden, aber anhand Spalte oder Fällungsverfahren auch gut zu entfernen unincorporated Primer und Einzelstrang-DNAs. Sequenz, die das 16S Amplicons unter Verwendung von Primer R910 (Tabelle 1), die Einrichtung, die Reaktionen, wie durch die Sequenzierung Anlage festgelegt. </li><li> Verwenden Sie das resultierende DNA-Sequenz, die NCBI DNA-Datenbank mit dem blastn Funktion (verhören <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Mehr als 97% Nukleotid-Identität wird in der Regel als Arten Identität gemacht. </li></ol> 7. Kartierung und Charakterisierung von Integrons und Kassetten-Arrays HINWEIS: Klasse 1 Integrons von Menschen dominierten Ökosystemen ausgeh sind wahrscheinlich die häufigsten Integrons in allen Proben sein. Diese Integrons alle einen letzten einzigen Ursprung, und haben daher eine hoch konservierte DNA-Sequenz 5. <ol><li> Unterscheiden zwischen einer Klasse 1 Integrons aus menschlichen Quellen ausgehen und die, die in Umweltproben natürlich vorkommen, indem einPCR mit Primersatz intI1F165 / intI1R476 10 (Tabelle 1). HINWEIS: Klasse 1 Integrons von klinischen oder kommensalen Bakterien ein ~ 300 bp-Produkt zu erzeugen, während der Umweltklasse 1 Integrons wird jedes Produkt erstellen. </li><li> Charakterisierung der klinischen Integrons durch Verstärken der Kassette Array mit Primer-Set HS458 / HS459. Dieses PCR wird die Region zwischen intI1 und konservierten Segment der 3&#39;an der Endstation der meisten Kassetten Arrays zu verstärken. Da die Anzahl und die Identität der Kassetten variabel ist, wird die Größe des PCR-Produkts variieren. </li><li> Reinige Amplicons und Reihenfolge der DNA unter Verwendung jeder der Amplifikationsprimer. Verwenden Sequenzen DNA-Datenbanken mit dem blastn Funktion (verhören <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Stellen Sie sicher, die Benennung von Kassetten folgen standardisierte Nomenklatur 9, da viele Daten Abscheidungen für Integron Genkassettes verwenden inkonsistent oder nicht eindeutige Namen. Sie besonderes Augenmerk auf neue Gen-Kassetten, da diese neue Phänotypen kodieren, darunter Gene, die erhöhte Durchlässigkeit, Pathogenität oder Virulenz 8,21 verleihen. HINWEIS: Präklinische Formen des Klassen 1 Integron zirkulieren immer noch in der natürlichen Umwelt. Insbesondere diejenigen, die aktive Transposons Tn 402 verbunden sind, sind von besonderem Interesse 26. Die Kassette Arrays dieser Integrons nicht mit Primer-Set HS458 / HS459 verstärken, kann aber mit dem MRG284 / MRG285 Primer-Set (Tabelle 1) amplifiziert werden, erzeugen Amplikons variabler Größe abhängig von Kassetteninhalt. PCR-Produkte sollten gereinigt und DNA sequenziert, wie in 7.2 beschrieben. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren relevant.

Die Identifizierung von Integrons und ihre zugehörigen Gen-Kassetten ist potentiell ein Schlüsselschritt bei der Vorhersage der Entstehung von neuen opportunistischen Erregern, Tracking Wege für Krankheitserreger in die menschliche Nahrungskette, und die Identifizierung neuer Widerstand und Virulenzdeterminanten 8,21,26. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen optimierten Ansatz für das Screening von Proben für die Klasse 1 Integrons, Charakterisierung ihrer Kassette Arrays und Identifizierung der Bakterien...

Die Entdeckung der Antibiotika war eine der größten wissenschaftlichen Errungenschaften des 20. Jahrhunderts. Allerdings hat der Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika, um der raschen Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterien geführt, und diese nun eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit in das 21. Jahrhundert. Der Aufstieg der Bakterienstämme resistent gegen die meisten Behandlungsmöglichkeiten eröffnet die Möglichkeit, betreten wir eine Ära, in der antimikrobiellen Arzneimitteln nicht mehr wirksam sind 1,2. Die genetische Maschinerie, die Antibiotika-Resistenz ist ein altes System, Zeit vor Menschen und antibiotischen Selektionsdruck durch Millionen von Jahren 3. Mobile genetische Elemente, wie Plasmiden, Transposons, genomische Inseln integrative konjugativen Elemente und Integrons kann Antibiotikaresistenzgenen (ARG) innerhalb und zwischen den Bakterienspezies 4 verbreiten. Von diesen wurden Integrons eine zentrale Rolle bei der Verbreitung von ARG trotz der spielte,Tatsache, dass sie verlassen sich auf Plasmide und Transposons für die Mobilisierung und das Einsetzen in bakterielle Genome 5. Integrons erfassen Genkassetten mit einem Integron-Integrase und dann zum Ausdruck Kassetten unter Verwendung eines Promotors codiert Integron 6,7 (Abbildung 1). Integron Genkassetten sind kleine mobile Elemente aus einzelnen offenen Leserahmen (ORF), deren Produkte Resistenz gegenüber Antibiotika oder Desinfektionsmittel 8. Klasse 1 Integrons die Integrons am häufigsten aus klinischen Isolaten 5, wo sie zusammen über 130 verschiedene Antibiotikaresistenzgen Kassetten 9 erfasst gewonnen. Die Verbreitung der Klasse 1 Integrons in menschliche assoziierten kommen und pathogenen Bakterien erzeugt menschlichen Abfallströme, die eine große Zahl von diesen genetischen Elemente 10 enthalten. Schätzungsweise 10 19 Bakterien, die Klasse 1 Integrons enthalten, werden über Klärschlamm pro Jahr i freigegebenn Großbritannien 11. Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Klasse 1 Integrons verleihen Antibiotikaresistenzen werden nun in Mikrobiota von wilden Vögel, Fische und andere einheimische Tierwelt 12-14 erkannt. Loslassen Integrons wieder an die Umgebung stellt eine erhebliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit, da Akquisition neuer Gen-Kassetten und komplexe Umlagerungen mit anderen mobilen Elementen auftritt weiterhin, insbesondere in Kläranlagen und anderen Gewässern 15-18. Die natürliche Umwelt wird dann zu einem fruchtbaren Rekrutierungsfeld für neue Resistenzdeterminanten und opportunistische Infektionen 19,20. Novel Integron haltigen Bakterien und neue ARG zurück in die menschliche Gemeinschaft durch verunreinigtes Wasser und Lebensmittel 21,22 umrunden. Überwachung der Umwelt ARG ist eine Schlüsselstrategie für das Verständnis und die Verwaltung Antibiotikaresistenz in der Zukunft 23. Insbesondere sollten ihr Augenmerk auf Nahrungsmittel zu achten, die roh gegessen werden oderleicht gekocht, denn diese stellen die größte Bedrohung für die Übertragung von neuen mobilen Elementen und Krankheitserreger. In diesem Protokoll einen optimierten Ansatz zur Erfassung, Identifizierung und Charakterisierung der Klasse 1 Integrons und ihre zugehörigen Genkassetten in Lebensmitteln werden skizziert (Abbildung 2). Verwendung einer Kombination von Kultivierung und Polymerasekettenreaktion (PCR) kann Integrons schnell komplexe Bakteriengemeinschaften und individuellen Isolaten nachgewiesen werden. Verfahren zum Identifizieren der Arten von Bakterien und die Konformation und die Identität der Integron assoziierten Genkassetten werden angegeben. Das Verfahren eignet sich für eine breite Palette von pflanzlichen und tierischen Lebensmitteln, und Beispiele für typische Arbeitsabläufe sind für jede dieser Arten von Lebensmitteln gegeben.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>HinFI restriction enzyme</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA</td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Used as a size standard on all agarose gels</td></tr><tr><td>GelRed DNA stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solution</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.</td></tr><tr><td>Binding matrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.</td></tr><tr><td>Fast Prep machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Number of options available</td><td>MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit &lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.mpbio.com&lt;/a&gt; for more information</td></tr></tbody></table>

screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

Screening von Mischkulturen und bakteriellen Isolate intI1 Primer-Set HS463a / HS464 PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein von der Klasse 1 Integron-Integrase-Gen, intI1 (Abbildung 1) zu erkennen. Diese Primer-Set eignet sich gut zur Erfassung intI1 in Mischkulturen, und wird auch verwendet, um Bakterienkolonien von Verteilerhaube (Abbildung 2) geerntet Bildschirm. Positive Isolate sollte eine einzige starke Bande bei 471 bp mit dies...

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

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Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Aufrufe.  Macquarie University. This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs. 

Serie: Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Forschung

Biotechnik

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Genetik

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized into five different toxinotypes, A through E, based on the carriage of four major toxin genes. The prevalence and distribution of these various toxinotypes is understudied, especially their pervasiveness in American retail food. Of particular interest to us are the type B and D strains, which produce epsilon toxin, an extremely lethal toxin suggested to be the environmental trigger of multiple sclerosis in humans. To evaluate the presence of different C. perfringens toxinotypes in various food samples, we developed an easy method to selectively culture these bacteria without the use of an anaerobic container system only involving three culturing steps. Food is purchased from local grocery stores and transported to the laboratory under ambient conditions. Samples are minced and inoculated into modified rapid perfringens media (RPM) and incubated overnight at 37 &#176;C in a sealed, airtight conical tube. Overnight cultures are inoculated onto a bottom layer of solid Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar, and then overlaid with a top layer of molten TSC agar, creating a &#34;sandwiched&#34;, anaerobic environment. Agar plates are incubated overnight at 37 &#176;C and then evaluated for appearance of black, sulfite-reducing colonies. C. perfringens-suspected colonies are removed from the TSC agar using sterile eye droppers, and inoculated into RPM and sub-cultured overnight at 37 &#176;C in an airtight conical tube. DNA is extracted from the RPM subculture, and then analyzed for the presence of C. perfringens toxin genes via polymerase chain reaction (PCR). Depending on the type of food sampled, typically 15&#8211;20% of samples test positive for C. perfringens.

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

The objective of this protocol is to detect different Clostridium perfringens toxinotypes in locally purchased foods, particularly epsilon toxin producing strain types B and D, without the use of anaerobic chambers.

Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Umwelt

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Assay f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Immunologie und Infektion

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Screening and Isolation of C-Glycoside-Cleaving Intestinal Bacteria

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, antioxidant, and antineoplastic activities. In C-glycosides, the anomeric carbon of the sugar moiety is directly connected to an aglycone through carbon-carbon bonding. Compared with O-glycosides, C-glycosides are structurally stable and resistant to acids and enzymes. Consequently, they are typically unbreakable, resulting in poor absorbability and low bioavailability. Interestingly, some intestinal bacteria can cleave C-C glycosidic bonds, providing a specific and environmentally friendly biological approach to degrade C-glycosides. In this study, a set of standard operating procedures (SOPs) was developed for screening intestinal bacteria capable of cleaving C-C glycosidic bonds based on the biotransformation model of natural compounds. The SOPs include the preparation and enrichment of intestinal bacteria, activity-oriented screening, and activity validation in a low-carbon source medium. This methodology provides a foundational reference for researchers aiming to isolate and study these specialized functional bacteria.

This study establishes a set of standard operating procedures (SOPs) for efficiently screening and isolating intestinal bacteria capable of cleaving C-glycosides.

Screening und Isolierung von C-Glykosid-spaltenden Darmbakterien

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, ...

Biochemie

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biologie

Einzelkopien-Genexpression zur Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Antibiotikaresistenzforschung mit einem Efflux-defizienten Bakterienstamm und einem Single-Copy-Genexpressionssystem

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten

Zusammenfassung

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Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben

Multiplex PCR Assay f

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Screening und Isolierung von C-Glykosid-spaltenden Darmbakterien

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems