Das Herz enthält eine heterogene Population von Immunzellen, die eine entscheidende Rolle bei Herzentzündungen und Reparaturen spielen. Um die Heterogenität von Immunzellen zu verstehen und weitere Einblicke in ihre Funktion zu gewinnen, ist es wichtig, eine Methode zu haben, die die Rückgewinnung dieser Zellen aus dem Herzen ermöglicht. Diese Technik kann helfen, die Immun- und Nichtimmunzellvielfalt aufzudecken, die im gesunden oder kranken Herzen liegt.
Diese Technik hat drei Hauptvorteile. Erstens ist es ein einfacher einfacher einfacher Workflow, der innerhalb von drei Stunden zur Erzeugung einer Einzelzellsuspension verschiedener Zelltypen führt. Zweitens führt es zu einer hohen Wiederherstellung lebensfähiger Immun- und Nichtimmunzellenpopulationen.
Und drittens ist es eine sehr vielseitige Methode und kann auch auf Herzgewebe in anderen Arten angewendet werden. Es ist wichtig, auf die Menge an Gewebe zu achten, die für eine einzige Verdauungsreaktion verwendet wird. Verwenden Sie sterile Schere, sezieren Gewebe Probe von der apikalen oder seitlichen Wand der linken Herzkammer in kalter Saline oder HBSS.
Sezieren Sie sorgfältig Epikardialfett und Chordaetendineae aus der Probe. Mit Hilfe einer sterilen Klinge oder Schere, sezieren Sie die Gewebestücke in Stücke mit einem Gewicht von etwa 200 Milligramm. Nach dem Einschläfern der Maus, öffnen Sie die Brusthöhle mit Hilfe einer scharfen Schere.
Verwenden Sie stumpfe Hämostate, um das Herz nach oben zu heben. Durchnässen Sie das Herz mit kaltem PBS mit einer 25-Meter-Nadel, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist. Durchdringen, bis das Herz in Farbe blanchiert erscheint.
Entfernen Sie das Herz und legen Sie es in eine sterile Petrischale auf Eis. Legen Sie 200 Milligramm menschliche Herzgewebebrocken oder murines Herz in eine sterile Petrischale. Das Gewebe mit einer sterilen Klinge oder Schere fein zerkleinern.
Um Verdauungen einzurichten, in einem 15 Milliliter konischen Röhrchen, bereiten Sie ein endgültiges Verdauungsvolumen von drei Millilitern für jeden menschlichen Herzgewebebrocken oder ein murines Herz mit den Enzymen Kollagenase I, DNase I und Hyaluronidase in Konzentrationen von 450, 60 und 60 Einheiten pro Milliliter vor. Fügen Sie 2,5 Milliliter DMEM in die Röhre. Mit Hilfe sauberer Zangen das fein gehackte Gewebe in jedes Reaktionsrohr legen.
Durch sanftes Wirbeln gut mischen. Verdauen Sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem schüttelarmen Inkubator auf eine niedrige bis mittlere Rührgeschwindigkeit eingestellt. Nach einer Stunde Verdauung die Schläuche aus dem Brutkasten nehmen und auf Eis legen.
Richten Sie 50 Milliliter konische Röhren mit einem 40 Mikron Zellsieb auf der Oberseite ein. Befeuchten Sie die Filter mit zwei Millilitern Enzymdeaktivierungspuffer. Als nächstes deaktivieren Sie die Verdauungsenzyme, indem Sie jedem Verdauungsröhrchen acht Milliliter Enzymdeaktivierungspuffer hinzufügen.
Dann gießen Sie die resultierenden 13 Milliliter Gesamtmischung durch das 40 Mikron Zellsieb in die 50 Milliliter konischen Röhren. Übertragen Sie die gefilterten Proben in frische 15 Milliliter Konusröhren. Drehen Sie die Proben bei 400 mal g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand und hinterlassen 0,5 Milliliter Medien. Setzen Sie das Zellpellet durch sanftes Pipettieren wieder auf und fügen Sie einen Milliliter ACK-Lysepuffer hinzu. Sanft wirbeln die Röhre und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um rote Blutkörperchen Lyse durchzuführen.
Fügen Sie nach fünf Minuten im ACK-Puffer der Probe neun Milliliter DMEM hinzu. Legen Sie den Deckel wieder auf die Rohre und kehren Sie die Rohre vorsichtig um, um sie zu mischen. Filtern Sie durch ein 40 Mikron Zellsieb und sammeln Sie das Filtrat in 15 Milliliter konischen Röhren.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 mal g für sechs Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie einen Milliliter FACS-Puffer hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf. Dann in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Zentrifugieren Sie wieder bei 400 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Eine Einzelzellsuspension ist nun bereit für die Antikörperfärbung.
Fügen Sie den Herzproben ein typisches menschliches Antikörperpanel bei einer bis 50 Verdünnung hinzu. Verwenden Sie verschiedene Antikörper für Stromalzellen und murine Herzmakrophagen. 30 bis 40 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.
Fügen Sie einen Milliliter FACS-Puffer, sanft Wirbel und Zentrifuge bei 400 mal g für fünf Minuten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein zweites Mal. Setzen Sie dann die Probe in 350 Mikroliter FACS-Puffer wieder aus und fügen Sie DAPI hinzu, um eine endgültige Konzentration von einem Mikromolaren zu erreichen.
Die Proben sind nun für die FACS-Analyse bereit. In diesem Protokoll wurde die Isolierung von Makrophagen von Maus und menschlichem Myokard erreicht. Diese Abbildung zeigt unverarbeiteten und verarbeiteten menschlichen LVAD-Kern.
Das Gatingschema für die Strömungssortierung von CCR2-negativen und CCR2-positiven menschlichen Makrophagen aus humanem Myokard sowie für CD45-negative Stromalzellen aus humaner ischämischer Kardiomyopathie wurde vorgestellt. Die Bilder von Wright gefärbt FACS sortiert CD45 positive und CD45 negative Zellen zeigen intakte Zellmembran, die Lebensfähigkeit. Das Gating-Schema zum Sortieren von Makrophagen aus einem Mausherz war ebenfalls erfolgreich.
Das Gewicht des Gewebes, das für die enzymatische Reaktion verwendet wird, ist entscheidend für eine effiziente Verdauung. Verwenden Sie nicht mehr als 200 Milligramm Gewebe für die im Protokoll angegebenen Enzymkonzentrationen. Nach dieser Methode können Zellen für In-vitro-Stimulationstests kultiviert werden.
Zellen können für die Massen-RNA-Sequenzierung oder die Einzelzellsequenzierung sortiert werden. Diese Methode diente als unschätzbare Technik bei der Entdeckung der bisher unbekannten Makrophagenheterogenität, die im gesunden oder kranken menschlichen Herzen vorhanden ist. Mit dieser Methode gefolgt von Einzelzell-Sequenzierung, Studien sind im Gange, um aufzudecken, wie verschiedene Immun- und Nichtimmunzellen von krankem Herzen im Vergleich zum gesunden Herzen variieren.
