Unser Protokoll ist für das Mausmodell optimiert und verwendet Materialien, die allen Forschern zur Verfügung stehen. Diese Technik kann auf gesunde, Krankheits- oder genetisch veränderte Mausmodelle angewendet werden. Unser Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, alle Fragen zur Herzperizytenbiologie aus jedem Mausmodell von Krankheiten oder genetischen Variationen zu beantworten.
Dieses Verfahren wird Einblicke in die Herzperizytenbiologie geben und uns helfen, ihren Beitrag zur Herzhomöostase und Hämodynamik sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheiten zu verstehen. Legen Sie die anästhesierte Maus in die Rückenposition und kleben Sie ihre Vorderbeine herunter. Öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und können Sie die absteigende Aorta mit einer 25-Spur-Schmetterlingsnadel impfen.
Machen Sie einen Nick im rechten Atrium. Dann durchdringen Sie das Herz mit mindestens 20 Millilitern 250 Einheiten pro Milliliter heparinisierter, kalzium-magnesiumfreier Dulbecco-Phosphat-Gepufferte Saline mit einer variablen Peristaltikpumpe. Die Perfusion ist vollständig, wenn sauberes PBS aus der rechten Vorgemenge kommt.
Schneiden Sie das Herz an der Aorta aus und legen Sie es in die eiskalte Calcium-Magnesium-freie DPBS. Dann übertragen Sie das Herz in eine 15 mal 15 Zentimeter große Petrischale. Schneiden Sie das Herz in winzige Stücke mit Federschere und Feinpunktzange mit genügend Enzymlösung, um die Stücke zu bedecken.
Nun die Teile und die Lösung in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen und mit Paraffin-Kunststofffolie versiegeln. Bei 37 Grad Celsius auf einem Orbital-Shaker bei 120 Rpm für 75 Minuten inkubieren. Nach der Kollagenase-Verdauung mit der Enzymlösung dekantiert die Flüssigkeit durch ein 100-Mikron-Zellsieb in eine neue 50-Milliliter-Röhre und hinterlässt so genügend Lösung, dass die Stücke nicht austrocknen.
Mit Feinpunktzangen nehmen Sie das Gewebe aus dem Rohr und legen Sie ein paar Stücke auf ein Mikroskopschlitten. Dann schleifen Sie das Gewebe zwischen zwei Mikroskop-Dias, um das Gewebe aufzubrechen. Spülen Sie die Dias mit enzymfreien Kulturmedien in eine neue 50-Milliliter-Konustube.
Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Gewebeteile getrennt sind. Kombinieren Sie die angespannte Lösung und das bodenleinige Gewebe in einem Rohr. Die resultierende Suspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Konusrohr abseihen.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 220 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Die vorherige Lösung abhaken und das Zellpellet im kalten FACS-Färbepuffer mit DPBS und Rinderserumalbumin vorsichtig wieder aufhängen. Zählen Sie die Zellen, und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mithilfe eines Zellenzählers.
Verdünnen Sie die Zellen auf eine Million Zellen pro Milliliter mit kaltem FACS-Färbepuffer, der DPBS und Rinderserumalbumin enthält. Die Zellen können nun gebeizt und sortiert werden. Vorbereiten und beschriften Sie FÜNF-Milliliter-FACS-Rohre für alle Steuerungen und Zellproben.
Aliquot einen Milliliter Zellen pro Röhre für eine ungefleckte Probe, Fluoreszenz minus one Kontrollen und isotypübereinstimmende Kontrollen. Verwenden Sie die verbleibenden Zellen für die Sortierung. Alle Bedienelemente und Proben können gleichzeitig vorbereitet und gebeizt werden.
Bereiten und beschriften Sie außerdem Fünf-Milliliter-FACS-Röhren für insgesamt neun Kompensationskontrollen, zwei Arten von ungefärbten Perlen sowie sieben verschiedene Fluorchrome aus dem Marker-Panel. Um die Fluoreszenzkompensationskontrollen zu optimieren, fügen Sie jedem Rohr einen Tropfen Kompensationsperlen aus der Quetschflasche hinzu. Dann fügen Sie einen Mikroliter Antikörper in die Perlen.
Wiederholen Sie dies für jeden Antikörper aus dem Marker-Panel. Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um die Hintergrundfärbung aufgrund von Spektralüberlappungen zu optimieren. Zu den Zellen in den FMO-Steuerröhrchen fügen Sie alle Antikörper aus dem Markerpanel bei einer Verdünnung von eins bis 100 hinzu, schließen jedoch einen Antikörper aus.
Wiederholen Sie dies für jeden Antikörper für insgesamt sieben Kontrollen. Verwenden Sie isotypmatched Kontrollantikörper für unspezifische Färbung. Zu den Zellen in den isotypübereinstimmenden beschrifteten Röhren fügen Sie den isotypübereinstimmenden Kontrollantikörper bei einer Verdünnung von 1 zu 100 hinzu.
Bereiten Sie als Nächstes die zu sortierenden Zellen vor. Zu den frisch isolierten Zellen einen Antikörpercocktail bei einer Verdünnung von eins bis 100 hinzufügen. Fügen Sie auch ZelllebensfähigkeitFarbstoff bei einer Ein-zu-1-Verdünnung hinzu.
Die Kompensationssteuerungen durch Pulswirbelung kräftig mischen. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht, mit Ausnahme der Zelllebensfähigkeit Sperlen, die bei Raumtemperatur gelassen werden können, vor Licht geschützt. Mischen Sie die FMO-Steuerelemente, die isotypmatched-Steuerelemente und die Zellen, die nach Pulswirbelung sortiert werden sollen, vorsichtig.
30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, vor Licht geschützt. Fügen Sie jeder Kompensationssteuerung, FMO-Steuerung und Isotypsteuerung drei Milliliter FACS-Färbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Apirieren Sie die Lösung, und setzen Sie jedes Pellet in 400 Mikroliter FACS Färbepuffer. Die Kompensationskontrollen, FMO-Kontrollen und Isotypsteuerungen können nun verwendet werden. Waschen Sie die Zellen nach der Färbung mit faCS-Färbepuffer durch Zentrifugieren bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Apirieren Sie die Lösung, und setzen Sie das Zellpellet im FACS-Färbepuffer auf 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter aus. Mit neuen FACS-Rohren mit 35-Mikron-Filterplatten pipettedien die gebeizten Zellproben auf die Deckel und Gravitationsfiltrat, um einzellige Suspensionen zu erhalten. Auf Eis bleiben.
Verwenden Sie einen Zellsortierer, um die Zellen zu reinigen. Führen Sie die unbefleckten Zellen auf dem Zellsortierer aus, um Spannungen festzulegen und das Hintergrundsignal zu korrigieren. Führen Sie jede einfarbige Kompensationsperlenprobe einzeln aus, um die Spannungen für jeden Kanal anzupassen und die Tore für das positive Signal anzupassen.
Sammeln Sie die Daten. Verwenden Sie die Software, um die Spektralüberlappung zu berechnen, indem Sie die Kompensationsmatrix berechnen. Alle Spannungen sind bereit und eingestellt.
Führen Sie jedes Isotypsteuerelement nacheinander aus. Diese Daten können verwendet werden, um Gates für unspezifische Bindung anzupassen, falls vorhanden. Führen Sie jedes FMO-Beispiel zu diesem Zeitpunkt ein.
Passen Sie die Spannungen für jeden Kanal an, um die Spektraldurchblutung durch ein mehrfarbiges Panel zu korrigieren. Führen Sie die gebeizten Zellproben im Zellsortierer aus. Sammeln Sie Zellen in 10-Milliliter-Enzym-freien Kulturmedien in einem 15-Milliliter-Konus-Sammelrohr.
Verwenden Sie die folgende Gating-Strategie. Erstens, Tor für einzelne Zellen. Dann Tor für lebende Zellen.
Als nächstes Gate für CD45-negative Zellen. Gate für CD34- und CD31-negative Zellen. Dann Tor für NG2-positive Zellen.
Und schließlich, Gate für CD146 und CD140b-positive Zellen. Um Perizyten zu kultiieren, säen Sie die frisch erhaltenen Zellen in enzymfreien Kulturmedien auf einer beschichteten 24-Well-Platte. Kultur die Zellen in einem Zell-Inkubator auf 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Sauerstoff eingestellt.
Nach der enzymatischen Verdauung und Dissoziation des ganzen Herzens und vor der FACS-Reinigung der Zellen sind Zellen eine rohe Mischung, die viele verschiedene Zelltypen aus dem Herzen enthält. Nach FACS-Reinigung und Kultivierung sind die Zellen homogen. Sie sind einzeln nukleiert, ziemlich flach, und haben die typische pericyte rhomboid Morphologie.
Mit FACS werden Zellen auf Homogenität gereinigt. Zuerst wurden Trümmer und Doublets basierend auf vorwärts- und seitlichen Streuverteilungen abgegrenzt. Dann wurden tote Zellen aufgrund ihrer Aminreaktion mit dem Farbstoff ausgesperrt, der ein Signal erzeugt, das größer und intensiver ist als lebende Zellen.
Von den lebenden Zellen wurden hämatopoetische Zellen durch CD45-positiv abgezäutt. Um hämatopoetische und endotheliale Zellen weiter zu entfernen, wurden CD34-positive und CD31-positive Zellen ausgeforert. Schließlich wurden NG2-positive und CD140b/CD146-positive Zellen als perivaskuläre Zellen mit Expression typischer Pericytmarker ausgewählt.
Im Vergleich zu den Pericyten des menschlichen Gehirns hatten die Zellen eine ähnliche Morphologie. Im Vergleich zu Maus- und menschlichen glatten Muskelzellen wiesen die Zellen eine andere morphologische phänotypische Charakterisierung von Zellen in Durchgang sieben durch Immunzytochemie für Pericytenmarker auf und zeigten keine beobachteten Veränderungen in der Morphologie oder Markerexpression. In ähnlicher Weise bestätigte die Analyse der Pericyten in Durchgang sieben durch Durchflusszytometrie, dass die Population homogen blieb.
Die Zelllebensfähigkeit ist entscheidend, um eine gute Ausbeute zu erzielen. Halten Sie Gewebe während der Beschaffung kalt und halten Sie Zellen während der Zellfärbung kalt. Stellen Sie außerdem sicher, dass die enzymatische Lösung jedes Mal frisch zubereitet wird.
Um die Isolierung der richtigen Zellen nach der Kultivierung zu gewährleisten, charakterisieren Sie sie mit Durchflusszytometrie und immunfluoreszierender Färbung. Diese Zellen können in Cokulturexperimenten mit Endothelzellen für funktionelle Barrierestudien sowie in Assays zur Untersuchung ihrer biologischen und physiologischen Funktion und Eigenschaften verwendet werden. Herzperizyten spielen eine grundlegende Rolle bei der Gefäßintegrität und -stabilität, und ihre Dysfunktion ist folgendär für die globale Herzfunktion.
Mit unserer Technik können Forscher das therapeutische Potenzial von Herzperizyten erforschen.
