Wir haben eine strenge Methode zur Isolierung von Zellen aus der Muttermilch entwickelt, um antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten gegen HIV-Ziele zu untersuchen. Diese Technik erleichtert die relativ schnelle und einfache Isolierung von Muttermilchzellen, um die Fähigkeit von Leukozytenpopulationen zur Durchführung von ADCP zu bewerten. Demonstriert wird das Verfahren von Alisa Fox, einer Technikerin aus meinem Labor.
Nach der Auswahl eines relevanten Zielantigens verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um das Protein von Interesse gemäß dem Herstellerprotokoll zu biotinyn. Und legen Sie die biotinylierte Probe in die obere Kammer einer Spinsäule. Fügen Sie PBS bis zu 400 Mikroliter hinzu und verschließen Sie die Kammer, bevor Sie die Säule zur Zentrifugierung in ein Sammelrohr einsetzen.
Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, fügen Sie PBS zu 400 Mikrolitern für eine zweite Zentrifugation hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss, fügen Sie PBS zu 400 Mikroliterhinzulierung hinzu und messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer, um das biotinylierte Protein zu Mikrometer-Mikrosphären zu konjugieren. Inkubieren Sie sechs Mikrogramm Protein mit 12 Mikroliter n. B. Stockperlen in 200 Mikroliter PBS pro Platte konjugierter Perlen bei Raumtemperatur für zwei Stunden, wobei alle 20 Minuten sanft wirbelt.
Am Ende der Inkubation, Pellet das Protein konjugierte Perlen durch Zentrifugation und entsorgen sie den Überstand. Nach sanftem Wirbeln das Protein in 1200 Mikrolitern 0,1%BSA in PBS wieder aufsetzen und das Rohr durch Zentrifugation noch zwei Mal waschen, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche das Pellet in 1200 Mikrolitern in PBS plus BSA wieder aufsetzen.
Um ADCP Assay Plates einzurichten, bereiten Sie zunächst 12 Mikroliter-Verdünnungen von Antikörpern oder dem Immunserum von Interesse in 2%BSA in PBS in einer runden unteren 96-Wellplatte vor. Fügen Sie 10 Mikroliter Protein konjugierte Perlen pro Brunnen auf den Teller für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation 200 Mikroliter PBS plus BSA hinzufügen.
Nach der Gewinnung von Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, die mit einer Pumpe ausdrücken, trennen Sie innerhalb von vier Stunden nach dem Ausdruck den Milchgehalt durch Zentrifugation und gießen Sie vorsichtig die Magermilch und das Fett ab, so dass das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen und 10 Milliliter PBS plus HSA hinzuzufügen. Setzen Sie das Pellet mit sanfter Pipettierung aus, um eine Zellaktivierung in der Apoptose zu vermeiden, und übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr.
Nach einer zweiten Wäsche in PBS plus HSA, wie gerade gezeigt, setzen Sie die Zellen vorsichtig in ein bis zwei Milliliter frische PBS plus HSA zum Zählen wieder ab. Für einen ADCP-Assay die vorbereitete ADCP-Platte schnell umkehren, um den Überstand nach der letzten Zentrifugation zu dekantieren und fünfmal 10 an einer vierten frisch isolierten Muttermilchzelle in 200 Mikroliter PBS plus BSA für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Zellen und waschen Sie die Pellets zweimal in 200 Mikroliter frischer PBS, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche, färben die Zellen mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter fixierbare Lebensfähigkeit Fleck 450 pro Brunnen in 50 Mikroliter PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen für zwei Waschungen in frischem PBS, wie gezeigt, und färben die Zellen für die Leukozytenmarker von Interesse für 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Zellen Zentrifugation, und waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter von 1%BSA plus PBS pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche die Pellets in 200 Mikroliter mit 0,5% Formaldehyd pro Brunnen 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, fixieren. Für die zytometrische Durchflussanalyse der Zellproben, stellen Sie ein Durchflusszytometer mit einem Hochdurchsatz-Plattenleser, um 175 Mikroliter Proben zurückzuziehen und 5000 Zellen pro Bohrkörper zu sammeln. Führen Sie das anfängliche Gating aus, um Doublets und Trümmer auf einem Vorwärtsstreuungs- oder Seitenstreuungsdiagramm zu beseitigen.
Verwenden Sie ein Seitenstreuungs-/Lebensfähigkeits-Fleckendiagramm, um die abgestorbenen Zellen zu beseitigen. Und verwenden Sie eine Seitenstreuung im Vergleich zu CD45-Plot, um die wichtigsten Leukozytenklassen zu unterscheiden. Für alle CD45-positiven Zellen oder für jede Vonbiot-Untermenge messen Sie die antikörperabhängige zelluläre Phagozytoseaktivität, indem sie mit einem Marker auf die Adad-positiven Zellen in einem Histogramm des entsprechenden Fluorophorkanals für die konjugierten Perlen gegating.
Berechnen Sie dann die Antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Werte als Median der Fluoreszenzintensität der Ad-positiven Zellen um den Prozentsatz der gesamten CD45 plus die Zellen in der positiven Population. Hier wird die Gating-Strategie zur Beseitigung von Doublets, Schutt und abgestorbenen Zellen gezeigt. Zwischen einem bis 12% aller lebenden Zellen sind in der Regel CD45-positive Leukozyten, wobei die meisten der angeblichen Seitenstreuung niedrig bis zwischen CD45 niedrige Monozyten scheinen Vorläufer zu sein, oder unreife Zellen, basierend auf der Seitenstreuung im Vergleich ZU CD45 Gating.
Die angeblichen Granulozyten werden als Side Scatter high, CD45 Zwischenzellen definiert. Die Messung der ADCP-Aktivität frisch isolierter Muttermilchzellen mit einem HIV-spezifischen humanen monoklonalen Antikörper nach einem Monat nach der Partikation zeigt, dass die Behandlung mit Actin-Hemmer Cytochalasin D und oder Fc-Rezeptor-blockierenden Antikörpern vor der Inkubation mit Antikörper gebundenen Antigen-gekoppelten Perlen zu der ADCP-Aktivität führt, die in Gegenwart von Kontrollantikörpern beobachtet wurde. Der ADCP-Score, der für insgesamt CD45-positive Zellen ermittelt wird, liegt in der Regel zwischen 25 und 35 Mal über den Hintergrundniveaus, definiert mit einem negativen Kontroll-, Anti-Anthrax-Monoklon-Antikörper.
Jede Muttermilchprobe ist einzigartig und einige Pellets können schwer zu sehen sein. Darüber hinaus können die Leukozytenpopulationen und damit die ADCP-Werte von Probe zu Probe sehr unterschiedlich sein.
