HIV-Infektion verursacht Immunfunktionsstörungen auch bei Personen, die sich einer antiretroviralen Therapie ohne nachweisbares Virus unterziehen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Monozytenfunktion, die wichtige Regulatoren der Immunantwort sind. Wir haben diese Technik für die Isolierung, Kultur und Transfektion menschlicher Primärmonozyten optimiert.
Wir verwenden diese Methode, um die molekularen Mechanismen der Immunfunktionsstörung bei HIV-infizierten Personen zu verstehen, aber es kann auf alle anderen Immunstudien mit Monozyten angewendet werden. Wenn Dies zum ersten Mal mit menschlichem Blut arbeitet, denken Sie daran, die richtigen Biosicherheitsprotokolle zu befolgen und alle Proben als möglicherweise infektiöses Material zu behandeln. Nach der Sammlung von 40 Milliliter frisches menschliches Vollblut in vier 10 Milliliter EDTA Vakuumröhren, verwenden Sie sterile Technik, um das gesamte Blut in einem einzigen 50 Milliliter konischen Propylen-Röhrchen in einem Biosicherheitsschrank zu übertragen.
Fügen Sie nach den Anweisungen des Herstellers aus einem ausgewählten menschlichen Monozyten-Isolationskit zwei Milliliter Monozyten-Isolationscocktail aus dem Kit in die Blutröhre und wirbeln die Magnetperlen aus dem Kit für 30 Sekunden. Fügen Sie dem Blut zwei Milliliter Perlen hinzu und verwenden Sie eine 25 Milliliter serologische Pipette, um die Perlen sorgfältig mit dem Blut zu mischen. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur das Blut gleichmäßig auf vier 50-Milliliter-Röhren aufteilen und 30 Milliliter sterile PBS hinzufügen, ergänzt mit einem Millimolaren EDTA zu jeder Röhre.
Mischen Sie die Rohre erneut mit einer 25-Milliliter-Serologischen Pipette aus Kunststoff und legen Sie die Rohre in magnetische Halterungen. Nach 10 Minuten verwenden Sie eine Pipette, um den Inhalt aus der Mitte jeder Röhre zu zeichnen, wobei darauf geachtet wird, nicht mehr als einen Milliliter roter Blutkörperchen zu saugen und den Rohrinhalt in eine von vier neuen 50-Milliliter-Röhren zu geben. Fügen Sie 500 zusätzliche Mikroliter der wirbelnden Magnetperlen in jede Röhre und mischen Sie die Zelllösung sanft.
Legen Sie die Rohre für fünf Minuten wieder in die Magnethalter, bevor Sie den Inhalt vorsichtig von der Mitte jedes Rohres in eine von vier neuen 50-Milliliter-Röhren übertragen. Wenn alle Zellsuspensionen übertragen sind, legen Sie jedes neue 50-Milliliter-Rohr für fünf Minuten in die Magnethalter, bevor Sie den Rohrinhalt vorsichtig in einen dritten Satz von vier neuen 50-Milliliter-Röhren übertragen. Dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie alle vier Zellpellets in insgesamt 10 Milliliter sterilen PBS zum Zählen wieder auf.
Nach dem Zählen die isolierten Monozyten um ein mal 10 bis sechs Milliliter 37 Grad Celsius serumfreies RPMI 1640 Medium, ergänzt mit Antibiotika, wieder aussetzen und einen Milliliter resuspendierten Zellen in 35-Millimeter-Platten in einem Biosicherheitsschrank versiebenen. Legen Sie dann die Platten 30 bis 60 Minuten in den Zellkultur-Inkubator, damit die Zellen an den Brunnenböden haften können. Um Makrophagen mit einem M1-ähnlichen Phänotyp zu grundieren, fügen Sie 100 Mikroliter fetales Rinderserum mit 25 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF zu jeder Platte hinzu.
Um Makrophagen mit einem M2-ähnlichen Phänotyp zu grundieren, fügen Sie 100 Mikroliter fetales Rind mit 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF zu jeder Platte hinzu. Zur Monozytentransfektion mit microRNA-Mimik, Inhibitoren oder einer kleinen störenden RNA, nach dem Herstellerprotokoll für das Transfektionskit, verdünnen Sie die ausgewählten RNAs im Puffer auf eine Endkonzentration von 1,83 Mikromolaren in 10 Mikrolitern verdünnter Mimik oder Inhibitor pro Transfektion von einem mal 10 auf das volumen der fünften Zellen. Zur Herstellung des Transfektionsreagenz einen Mikroliter des mitgelieferten Polymers in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben und sofort 90 Mikroliter des mit dem Kit bereitgestellten Puffers hinzufügen, um insgesamt 91 Mikroliter Reagenz pro Transfektion zu erhalten.
Wirbel den Regenten für drei bis fünf Sekunden und Pipette 90 Mikroliter der Transfektionslösung in die Röhre mit 10 Mikroliter verdünnter RNA. Nach dem sanften Mischen die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bevor Sie 100 Mikroliter Transfektionskomplex zu einem Bohrkörper der Zellen hinzufügen. Nach vier Stunden bei 37 Grad Celsius das Medium durch drei Milliliter komplettes Medium ersetzen, das den entsprechenden Wachstumsfaktor enthält.
Ersetzen Sie am sechsten Tag der Kultur die Kulturüberstandstoffe aus den M1-Kulturen durch drei Milliliter Medium, ergänzt durch fetales Rinderserum, Antibiotika, Lipopolysaccharid und Interferon-Gamma, und ersetzen Sie die Überdräuer aus den M2-Kulturen durch Medium, das mit fetalem Rinderserum, Antibiotika, M-CSF und Interleukin-4 ergänzt wird. Nach 24 Stunden Kultur, waschen Sie jede Platte mit aktivierten Makrophagen zweimal mit frischen PBS pro Wäsche. Für RNA- und Proteinanalysen lysieren Sie die angeschlossenen Zellen direkt in den Platten, um die Entnahme der freigesetzten Zellinhalte für ihre Analyse zu ermöglichen.
Für die zytometrische Durchflussanalyse lösen Sie die Zellen mit zwei Millimolaren EDTA in PBS für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen vorsichtig von den Plattenböden kratzen, um ihre Sammlung in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren für ihre Analyse zu ermöglichen. Hier werden repräsentative Histogramme von M1-aktivierten Kontrollzellen und patientenabgeleiteten Zellen mit erhöhten Konzentrationen von CD80- und CD83- und M2-aktivierten Zellen mit erhöhtem CD163- und CD209-Spiegel im Vergleich zu nicht aktivierten T0-Zellen gezeigt. Interessanterweise schienen CD80 und CD83 in kontrollabgeleiteten Zellen stärker exprimiert zu sein als in HIV-abgeleiteten Zellen.
Die Transfektion von frisch gesammelten Monozyten mit einer gerifflten, nahinfrarot markierten microRNA führt zu einer Wirkungsgrad von mehr als 90 %, die durch Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie bestimmt wird. Darüber hinaus reduziert die Transfektion die Lebensfähigkeit von patientenabgeleiteten oder Kontrollzellen unabhängig vom Stadium der Zellreifung oder den Transfektionsbedingungen nicht signifikant. Transfektion führt zu einer effektiven Downregulation des Zielgens bei Transfektion mit der spezifischen kleinen störenden RNA sowohl am ersten Tag als auch am vierten Tag nach der Isolation.
Darüber hinaus zeigen Zellen, die mit microRNA-Mimik transfiziert wurden, eine 48- bis 72-fache Zunahme der microRNA-Expression über untransfizierte Zellen, während alle Transfektionskontrollen keine nennenswerten Veränderungen aufweisen. Die Anzahl der plattierten Zellen ist überlebenswichtig. Wir empfehlen eine Million Zellen pro 35-Millimeter-Schale.
Die Beschichtung in serumfreiem Medium wird auch die Zellanhaftung erheblich verbessern. Zellen, die mit dieser Methode gewonnen werden, können mit Zytokinen oder Wachstumsfaktoren behandelt werden, um differentiale Reaktionen bei Patienten von Interesse und gesunde Kontrollen zu untersuchen.
