Mikrophysiologische Systeme haben die Fähigkeit, pharmakokinetische und die toxikologische Reaktion des menschlichen Körpers auf spezifische Behandlungen von Interessen zu emulieren. Mikrophysiologische Systeme haben das Potenzial, Tierversuche zu ersetzen, da ihre Verwendung die Vorhersagekraft von In-vitro-Methoden verbessern und die Kosten und die Zeit pharmakokinetischer und toxikologischer Studien reduzieren kann. 24 Stunden vor der Verabreichung der Prüfsubstanz ein 800-Mikroliter-Aliquot von William ES-Medium zwischen den größeren und kleineren Fächern der beiden Organchips aufteilen und das basolaterale und apikale Medium aus jedem Darmbarriereäquivalent in den vorbereiteten 24 Bohrplatten ansaugen.
Mit sterilen Zangen einen Einsatz pro zwei Organchip-Schaltung in das größere Fach integrieren und 200 Mikroliter DMEMS auf die apikale Seite geben. Mit breiten Bohrungsspitzen 20 Leberäquivalente pro Schaltung in das kleinere Fach der beiden Organchips integrieren und das System an das Steuergerät anschließen. Schließen Sie dann das Steuergerät an eine Druckluftzufuhr an und stellen Sie den Druck auf etwa plus oder minus 300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hertz ein.
Am nächsten Tag die Acetaminophen-Lösung des Lagers auf eine Konzentration von 12 Mikromolaren verdünnen. Um das Medium im System zu ersetzen, saugen Sie die basolateralen und apikalen Medien aus dem Darmbarriereäquivalent in den beiden Organchips und fügen Sie 500 Mikroliter frisches geeignetes Kulturmedium in das große Fach an der organoiden basolateralen Seite und 300 Mikroliter in das kleine Fach ein. Nach der Prüfung auf Blasen, emulieren orale Verabreichung mit der Zugabe von 200 Mikroliter einer 12 Mikromolar Acetaminophen Lösung auf der apikalen Seite der Darmkultur Einsätze und verbinden Sie das mikrophysiologische System an die Steuereinheit.
Sammeln Sie das Gesamtvolumen sowohl von den Darm-apischen und basolateralen Seiten, als auch aus dem kleinen Fach in dreifacher Auslage zu den angegebenen Zeitpunkten. Wenn alle Proben gesammelt wurden, stellen Sie alle relevanten Parameter für die HPLC-Analyse ein, wie in der Tabelle angegeben, und filtern Sie die mobile Phase durch einen 0,4-Mikron-Membranfilter unter Vakuum. Filtern Sie die Proben dann durch einen PVDF-Spritzenfilter in Porengröße von 0,22 Mikron und lagern Sie die Proben in einer Durchstechflasche, bevor Sie mit der HPLC-UV-Messung beginnen.
Um die Organoid-Lebensfähigkeit zu beurteilen, übertragen Sie alle 20 Sphäroide von jedem Replizieren auf einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte und übertragen Sie die Zellkultureinsätze auf einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie die Gewebeäquivalente dreimal mit frischen DPBS pro Wäsche und fügen Sie 300 Mikroliter einer ein Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung zu jedem experimentellen Brunnen hinzu. Nach einer dreistündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator ersetzen Sie die MTT-Lösung durch 200 Mikroliter Isopropanol pro Brunnen für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius, um das MTT-Formazan aus dem Darm und den Leberäquivalenten zu extrahieren.
Am nächsten Morgen 200 Mikroliter jedes Überstandes in die 96-Well-Platte übertragen und das Formazan auf einem Plattenleser bei 570 Nanometern ablesen, um die Berechnung der relativen Fähigkeit der Zellen zu ermöglichen, MTT unter Verwendung der durchschnittlichen optischen Dichte jedes Zeitpunkts im Vergleich zur negativen Kontrolle zu reduzieren. Für die zytochemische und histologische Analyse der Proben, fixieren Sie zunächst den Darm und Leberäquivalente in 4%Paraformaldehyd in 0,1 moligen PBS für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Organoide fünfmal in PBS für 10 Minuten pro Wäsche waschen, bevor Sie die Darm- und Leberäquivalente mit Tetramethylrhodamine Isothiocyanat Phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin für eine Stunde bei Raumtemperatur färben.
Am Ende der Inkubation die Proben für einige Minuten auf das Gefriermedium übertragen, bevor sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Als nächstes verwenden Sie ein Kryostat, um 10 bis 12 Mikrometer dicke Lebersphäroid-Kryo-Abschnitte zu erwerben und die Gewebeabschnitte in Montagemedium mit DAPI für die Bildgebung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie zu montieren. Für die mitochondriale und nukleare Färbung die Proben vollständig mit mitochondrialer Färbungslösung für eine 15- bis 45-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid abdecken.
Am Ende der Inkubation die Färbelösung bei Raumtemperatur 15 Minuten lang sorgfältig durch 2 bis 4% Paraformaldehyd in PBS ersetzen. Nach der Fixierung die Zellen zwei Mal mit frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche abspülen, bevor Sie die Proben mit Nukleinsäure-Färbungsarbeitslösung 10 Minuten bei Raumtemperatur beschriften. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Proben mit drei, fünf minütigen, lichtgeschützten Wähmern in PBS und verwenden Sie den Nukleinsäurefleck, um die Quantifizierung der Anzahl der mitochondrialen Fleckenexzierungszellen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtersätzen zu erleichtern.
Die Integration der menschlichen Darmbarriere und eines Leberäquivalents in ein mikrofluidisches Gerät mit zwei Organchips ermöglicht die Beurteilung der pharmakokinetischen und toxikologischen Eigenschaften von Behandlungen von Interesse. Nach der Behandlung können die Medienproben per HPLC analysiert werden. Die Organoide können auf ihre Genexpression, transepitheliale elektrische Widerstandswerte, Proteinexpression und -aktivität sowie auf ihre morphologischen Eigenschaften analysiert werden.
MTT-Analyse kann durchgeführt werden, um die Organoid-Lebensfähigkeit zu bewerten, sowie sehr frühe toxische Ereignisse als Reaktion auf Acetaminophen-Behandlung zu erkennen. Der Medienfluss hat keinen signifikanten Einfluss auf die Acetaminophen-Absorption, während er die Funktion des Leberäquivalents signifikant verbessert, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme von humanem Darmacetaminophen und Leberstoffwechsel in diesem mikrophysiologischen System emuliert werden kann. Mikrophysiologische Systeme haben das Potenzial, Tiermodelle in der Arzneimittelentwicklung und -entdeckung zu ersetzen, da sie die menschliche Physiologie besser nachahmen und verwendet werden können, um die Arzneimittelentwicklung mit höherer Geschwindigkeit und niedrigeren Kosten für Risiko und Komplexität zu fördern.
