Das Protokoll beschreibt, wie medikamenteninduzierte Leberschäden in vitro mit einem mikrophysiologischen System beurteilt werden können, das hochfunktionelle und metabolisch aktive Lebermikrogewebe für bis zu vier Wochen aufrechterhalten kann. Dieser Ansatz ist ein humanspezifisches Zellkulturmodell zur genauen Erkennung der medikamenteninduzierten Leberschädigungshaftung für neuartige Verbindungen, was prädiktiver ist als einfachere 2D-Kulturen oder noch komplexere 3D-Kulturen. Diese Technik kann als Teil einer Reihe von präklinischen Sicherheitstests verwendet werden, um festzustellen, ob eine Verbindung für den Beginn der klinischen Entwicklung sicher ist.
Eine Vielzahl von Modalitäten kann getestet werden. Beginnen Sie mit der Einrichtung des mikrophysiologischen Lebersystems, indem Sie den Controller mit dem Dockingstationshaus in einem Zellkulturinkubator verbinden. Stellen Sie sicher, dass frisches Trockenmittel in das Trockenmittelglas auf der Rückseite des Controllers gegeben wird.
Nachdem Sie den Controller durch Drücken des Bootswippschalters eingeschaltet haben, warten Sie fünf Minuten, bis sich das System stabilisiert und Druck erreicht hat. Nehmen Sie jeden Teller aus der Verpackung. Als nächstes bereiten Sie jedes Bohrloch vor, indem Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes DMEM-Medium auf der Reservoirseite hinzufügen.
Setzen Sie den Treiber auf die Dockingstation im Inkubator. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie das Hauptprogramm auf dem Controller-Bildschirm, bis die Flüssigkeit durch die Filterhalterungen kommt. Um den Oberflächenkanal abzudecken, füllen Sie alle Vertiefungen mit 1,1 Milliliter erweitertem DMEM-Medium.
Nachdem Sie die Treiber mit Platten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gelegt haben, schließen Sie die Dockingstation an und führen Sie das Inkubationsprogramm aus. Auftauen Sie Fläschchen mit PHHs und HJCs, indem Sie die Fläschchen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad halten, bis nur noch ein kleiner Splitter Eis übrig bleibt. Nach dem Auftauen pipetten Sie vorsichtig maximal zwei Fläschchen PHHs direkt in ein Röhrchen mit vorgewärmtem kryokonserviertem Hepatozyten-Rückgewinnungsmedium, CHRM-Medien.
Verwenden Sie dann einen Milliliter CHRM, um die verbleibenden Zellen aus dem Kryoröhrchen zu waschen. Pipettieren Sie die HKCs vorsichtig aus dem Kryorohr in 10 Milliliter Eiskaltsaat fortschrittliches DMEM-Medium in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Später zentrifugieren Sie beide Zelltypen getrennt bei Raumtemperatur bei 100 mal G für 10 Minuten.
Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und suspendieren Sie die PHHs in warmem DMEM-Medium und HKCs in eiskaltem DMEM-Medium mit einem Milliliter pro Durchstechflasche der dem Röhrchen hinzugefügten Zellen. Suspendieren Sie die Zellen mit einer sanften Schaukelwirkung und legen Sie sie dann auf Eis. Wenn suspendiert, zählen Sie die Zellen und notieren Sie die Lebensfähigkeit.
Zelllebensfähigkeit muss über 85% liegenAls nächstes trennen Sie den Treiber von der Dockingstation und legen Sie den Treiber in die mikrobiologische Sicherheitswerkbank oder MBSC. Dann saugen Sie das Medium von oberhalb des Gerüsts zum Haltepunkt, Kanal und Reservoir ab und lassen ein Totvolumen von 0,2 Milliliter im Kulturbrunnen zurück, das knapp über das Gerüst reicht. Geben Sie 400 Mikroliter fortschrittliches DMEM-Medium in die Bohrlochkammer, bevor Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator setzen und das Medienwechselprogramm drei Minuten lang ausführen.
Trennen Sie den Treiber nach drei Minuten von der Dockingstation, und setzen Sie ihn wieder in den MBSC ein. Saugen Sie das Medium vom obigen Gerüst bis zum Haltepunkt und am Reservoirende jedes Bohrlochs ab, anschließend suspendieren Sie die PHHs erneut, indem Sie das Rohr vorsichtig schaukeln und das erforderliche Volumen der Zellsuspension zu jeder Kulturmulde hinzufügen. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über das Plattengerüst zu gewährleisten.
Setzen Sie HKCs vorsichtig wieder aus und fügen Sie die Zellsuspensionen zu jeder Kultur hinzu. Sobald alle Vertiefungen beide Zelltypen enthalten, platzieren Sie das mikrophysiologische System oder den MPS-Treiber auf der Dockingstation im Inkubator, ohne eine physische Verbindung herzustellen, um eine Stunde lang zu stehen. Sobald eine Stunde vergangen ist, verbinden Sie den Treiber mit der Dockingstation und führen Sie das Seed-Programm aus.
Wenn das Programm automatisch nach zwei Minuten pausiert, entfernen Sie den Treiber aus dem Inkubator und fügen Sie langsam 1.000 Mikroliter des fortschrittlichen DMEM-Mediums zum Kanal hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1,4 Milliliter zu erreichen. Bewegen Sie später die Platten in den Inkubator und führen Sie den Rest des Saatgutprogramms acht Stunden lang aus. Pausieren Sie am vierten Tag das Programm auf dem Controller und trennen Sie den Treiber und die Platte von der Dockingstation.
Übertragen Sie sie in ein MBSC. Verwenden Sie eine Pipette, um manuell etwa einen Milliliter Medien aus jeder Vertiefung für die Analyse löslicher Biomarker zu sammeln, ohne die Zellkultur durch Berühren des Gerüsts zu stören. Kennzeichnen Sie die gesammelten Medien als Proben für den vierten Tag und führen Sie Laktatdehydrogenase- und Harnstofftests als Qualitätskontrolle durch, um sicherzustellen, dass die Aussaat erfolgreich war.
Als nächstes dosieren Sie jede Vertiefung gemäß dem Plattenplan, indem Sie den Medienwechsel durchführen. Wenn Sie fertig sind, setzen Sie den Treiber wieder in die Dockingstation im Inkubator ein und führen Sie das Inkubationsprogramm aus. Trennen Sie am sechsten Tag den Treiber und das Kennzeichen von der Dockingstation und wechseln Sie zu einem MBSC.
Verwenden Sie eine Pipette, um etwa einen Milliliter Medien aus jeder Vertiefung zu entnehmen, und kennzeichnen Sie die Proben 48 Stunden nach der Verabreichung und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius für spätere Assays. Entfernen Sie am achten Tag die Gerüste mit einer Pinzette von den Platten und legen Sie die Gerüste in eine 24-Well-Platte, die 500 Mikroliter DPBS ohne Kalzium und Magnesium in jeder Vertiefung enthält, ohne das Mikrogewebe zu stören. Machen Sie die Schnappschüsse jedes Gerüsts unter einem Inverslichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
Am vierten Tag, vor der Medikamentendosierung, wurde eine Qualitätskontrolle des gebildeten Lebermikrogewebes mit LDH-Freisetzung und Harnstoffsynthese durchgeführt. Am achten Tag wurden mehrere Gesundheits- und Lebermetriken wie Albumin, Harnstoff, CYP drei A vier, ATP bewertet, um ein hohes Maß an Leberfunktionalität und Reproduzierbarkeit in den Mikrogeweben zu bestätigen. Kontrastphasenmikroskopie und IF-Färbung in den Lebermikrogeweben zeigten die gleichmäßige Verteilung der HKCs in den PHH-Mikrogeweben.
Die akute Exposition der Lebermikrogewebe gegenüber Troglitazone verursachte Toxizität, die durch Alaninaminotransferase oder ALT nachgewiesen wurde, und LDH-Freisetzung und eine schnelle Verringerung der Albumin- und Harnstoffproduktion. Der ATP-Gehalt und die Aktivität CYP drei A vier bestätigten die durch Troglitazone verursachte Toxizität, und die EC50-Werte waren mit anderen Endpunkten sehr vergleichbar. Die hellfeldmikroskopischen Bilder, die nach achttägiger Kultur im MPS aufgenommen wurden, zeigen ein gesundes Lebermikrogewebe, das gleichmäßig im gesamten Gerüst der Fahrzeugsteuerung ausgesät ist.
Gewebetod oder -abbau wurde bei den Replikaten beobachtet, die mit Positivkontrolle und Troglitazone behandelt wurden. Darüber hinaus wurde auch die Lebertoxizität nach Exposition gegenüber Pioglitazon untersucht. Es wurde keine LDH- oder ALT-Freisetzung festgestellt, jedoch wurde nach 48 Stunden eine leichte Verringerung der Albumin- und Harnstoffproduktion beobachtet.
Bei hohen Pioglitazon-Konzentrationen wurde eine geringfügige Verringerung des ATP-Gehalts beobachtet. Aus den Dosis-Wirkungs-Kurven wurden EC50-Werte generiert. Die Mikroskopie zeigte eine leichte Veränderung des Mikrogewebes nach 96 Stunden Exposition gegenüber Pioglitazon in den beiden höchsten getesteten Konzentrationen.
In der Studie ist die Verwendung von Zellen mit guter Qualität und Lebensfähigkeit über 85% unerlässlich für die Erzeugung hochfunktioneller und gesunder 3D-Mikrogewebe im mikrophysiologischen System. Nach diesem Verfahren können wir Adenin- und Arzneimittelwechselwirkungen und medikamenteninduzierte Leberschäden an Krankheitsmodellen wie der nicht-alkoholischen Delta-Hepatitis oder dem nicht-alkoholischen Fettleber-Krankheitsmodell beurteilen, das eine Dreifachkultur von Leberparenchym- und Nicht-Parenchymzellen verwendet.
