Diese Methode kann helfen, Bestäubungsanforderungen in verschiedenen Arten zu bestimmen und Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten zu etablieren. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Bewertung mehrerer Inkompatibilitäten unter Laborbedingungen ermöglicht. Vermeidung der zahlreichen Probleme, die bei Experimenten auftreten können, die unter Feldbedingungen durchgeführt werden.
Dies ermöglicht die Identifizierung zusammen mit der Widmung einer Reihe von Sorten an die entsprechenden Inkompatibilitätsgruppen. Bestimmung der Interkompatibilitätsbeziehung zwischen Sorten. Dieser Ansatz kann auch nützlich sein, um Selbstinkompatibilität und Inkompatibilitätsbeziehung in anderen Obstbaumkulturen wie Kirsche oder Pflaume zu bestimmen.
Beginnen Sie mit der Probenahme der Blumen im Feld. Sammeln Sie die Blumen in der Ballonstufe, was Stufe 58 auf der BBCH-Skala für Aprikosen entspricht, um eine vorherige Bestäubung zu vermeiden. Im Labor entfernen Sie die Anther der Blumen und legen Sie sie auf ein Stück Papier, um bei Raumtemperatur zu trocknen.
Nach 24 Stunden die Pollenkörner mit einem feinen 26-Millimeter-Netz absieben. Entleeren Sie eine Gruppe von 30 Blüten in der gleichen Ballonentwicklungsphase für jede Selbst- und Kreuzbestäubung und legen Sie die Pistolen 24 Stunden nach der Entschärfung auf Floristschaum in Wasser und bestäuben Sie die Pistolen mit einem Pinsel mit Pollen aus Blumen derselben Sorte. Bestäuben Sie einen weiteren Satz Pistolen jeder Sorte mit Pollen aus Blumen eines kompatiblen Bestäubern als Kontrolle.
Nach 72 Stunden die Pistolen vom nassen Floristenschaum entfernen und die Pistolen in einer fixativen Lösung von 3:1 Ethanol auf Essigsäure für mindestens 24 Stunden bei 4 Grad Celsius fixieren. Dann entsorgen Sie das Fixativ und fügen Sie 75% Ethanol hinzu, um sicherzustellen, dass Proben vollständig in die Lösung eingetaucht sind. Die Proben können bis zum Gebrauch im Ethanol bei 4 Grad Celsius gelagert werden.
Streuen Sie die Pollenkörner der gleichen Sorten, die zur Kontrolle von Bestäubungen im erstarrten Pollenkeimmedium verwendet werden, und beobachten Sie sie nach 24 Stunden unter dem Mikroskop. Bereiten Sie die Pistolen für die Mikroskopie vor, indem Sie sie 3 Mal mit destilliertem Wasser für eine Stunde pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche, lassen Sie sie in 5%Natriumsulfit bei 4 Grad Celsius für 24 Stunden.
Dann autoklavieren Sie sie mit einem Kilogramm pro Zentimeter quadratisch für 10 Minuten in Natriumsulfit, um das Gewebe zu erweichen. Legen Sie die autoklavierten Pistolen über eine Glasrutsche und verwenden Sie ein Skalpell, um die Trichome um den Eierstock zu entfernen. Dann zerquetschen Sie die Pistole mit einem Deckglas.
Tragen Sie einen Tropfen Anilineblau über die Präparate auf, um lästige Ablagerungen während des Pollenrohrwachstums zu färben, und beobachten Sie die Pollenröhren entlang des Stils mit einem Mikroskop gemäß Manuskriptanweisungen. Verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um genomische DNA aus jungen Blättern zu extrahieren, die im Frühjahr gesammelt wurden. Dann PCR einrichten, indem Sie Reagenzien nach Manuskriptanweisungen kombinieren.
Wirbeln des Reaktionsmixes und Verteilung unter den Brunnen in der PCR-Platte. Fügen Sie 1 Mikroliter der DNA-Verdünnung in jeden Brunnen und führen SIE PCR mit dem Thermo-Cycling-Programm im Manuskript skizziert. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, analysieren Sie die Ergebnisse mit Kapillarelektrophorese oder Agarose-Gel-Elektrophorese.
Für die Kapillarelektrophorese fügen Sie 1 Mikroliter des PCR-Produkts in den Brunnen der Leseplatte zusammen mit 1 Tropfen Mineralöl, um eine Wasserverdunstung zu verhindern. Bereiten Sie dann die Trennplatte durch Zugabe von Trennpuffer vor. Verwenden Sie die kommerzielle Software für den Genanalysator, um eine neue Probenplatte zu erstellen und die Probennamen für alle Brunnen auf der Platte zu speichern.
Wählen Sie dann die Analysemethode aus und fügen Sie die beiden Platten in den Genanalysator ein. Füllen Sie das Kapillararray mit destilliertem Wasser. Laden Sie das lineare Polyacrylamid-Gel und klicken Sie auf Ausführen.
Wenn die Analyse der PCR-Ergebnisse mit Gelelektrophorese ergibt, bereiten Sie ein 1%Agarose-Gel vor, indem Sie Agarose in Elektrophorese-Laufpuffer nach Manuskriptrichtungen auflösen. Dann 4 Mikroliter Nukleinsäurefleck in das Gel geben und sanft mischen. Richten Sie ein Geltablett mit einem Kamm und Verlangsamung gießen Sie das Gel in der Mitte unter Derherstellung, um Blasen zu vermeiden.
Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur, bis es vollständig erstarrt ist, ca. 30-45 Minuten. Dann in die Elektrophoresekammer geben. Entfernen Sie den Kamm und bedecken Sie ihn mit 1x TAE Puffer.
Laden Sie das Gel mit der DNA-Leiter gefolgt von den PCR-Produkten gemischt mit Ladefarbstoff. Dann laufen Sie das Gel bei 90 Volt für 60-90 Minuten, bis die blaue Färbelinie bei etwa 75% der Gelspur ist. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, visualisieren Sie das Gel mit einem Transilluminator.
Das Wachstum der Pollenröhrchen in Selbst- und Kreuzbestäubungen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, um die Selbstverträglichkeit für jede Sorte zu bestimmen. Kultivaren wurden als selbstkompatibel betrachtet, wenn Pollenrohrwachstum verhaftet wurde und selbstkompatibel, wenn mindestens ein Pollenrohr die Basis des Stils erreicht. 5 Primerpaarkombinationen wurden verwendet, um S-Allele mit PCR in Kombination mit Kapillar- oder Gelelektrophorese zu identifizieren.
Zunächst wurden die S-Allele durch die Verstärkung des ersten S-RNase-Introns mit dem SRc-Primerpaar identifiziert. Dann wurde das zweite Intron der RNase mit drei Primersätzen verstärkt, um S6, S9, S1 und S7 Allele zu unterscheiden. Und die V2- und HVB-Variablenregionen des SFB-Gens wurden mit dem AprFBC8-Primer verstärkt, um die Sc- und S8-Allele zu identifizieren.
Sobald die S-Allele identifiziert wurden, können verschiedene Inkompatibilitätsgruppen mit den Genotypen festgestellt werden, die interinkompatibel sind. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, die Kontrolle in der Kapillarelektrophorese zu verwenden, da sie ein automatisches Fragmentanalysesystem verwenden, das mehr Unterschiede in der Fragmentgröße melden kann, was zu einer ungenauen Allele-Identifikation führt. Die Kombination von Mikroskopie-Beobachtungen und genetischer Analyse hat zu einem sehr nützlichen Ansatz geführt, um die Selbstinkompatibilität in Aprikosen zu bestimmen und die Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten zu etablieren.
Selbstinkompatibilität ist jetzt die Verbindung zu Einheimischen in Aprikosen. Die Bestimmung der Faktoren scheint eine Rolle zu spielen. Zukünftige Anstrengungen müssen sich auf die genetische Erbauung dieser Sorte in Aprikosen konzentrieren.
Die Kombination dieses dokumentarischen Ansatzes ergibt wertvolle Informationen für die angemessene Auswahl von Sorten in kommerziellen Obstgärten und Mustergenotypen in Aprikosenzuchtprogrammen. Ein ähnlicher Ansatz kann in anderen holzigen mehrjährigen Kulturen verwendet werden.
