Wie Zellen die Proteinhomöostase aufrechterhalten, ist im Zusammenhang mit zellulärem Stress und Seneszenz nicht gut verstanden. In diesem Protokoll bieten wir eine einfache und genaue Möglichkeit, den Proteinumsatz zu berechnen, der eine Schlüsselkomponente der Proteinhomöostase in lebenden Zellen ist. Pulse SILAC gibt einem Experimentator die Möglichkeit, den Proteinumsatz für einzelne Proteine und das gesamte Proteom in einer Hochdurchsatzweise zu messen, die auch für biologische Systeme authentischer ist als andere Methoden.
Die Prinzipien dieser Methode können auf jedes System angewendet werden, das metabolisch markiert werden kann, einschließlich ganzer Organismen. Diese Methode kann auch zu Erkenntnissen über zelluläre Seneszenz, Alterung und neurodegenerative Erkrankungen führen. Die massenspektrometrische Analyse ist hochempfindlich gegenüber bestimmten chemischen Verunreinigungen wie Reinigungsmitteln.
Verwenden Sie während dieses gesamten Vorgangs Reagenzien der LC-MS-Klasse, um eine qualitativ hochwertige Datenerfassung zu gewährleisten. Um mit der metabolischen Markierung der Zellen zu beginnen, ersetzen Sie die Medien für jeweils drei Platten von seneszenten und ruhenden Zellen durch 30 Milliliter SILAC Light-Medien. Ersetzen Sie das Medium für drei seneszente und drei ruhende Platten separat durch 30 Milliliter SILAC Heavy.
Züchten Sie die Zellen drei Tage lang, ohne das Medium zu wechseln. Um die Zellen von den Kulturplatten zu lösen, fügen Sie jeder Platte fünf Milliliter vorgewärmtes Trypsin-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Später suspendieren Sie die abgelösten Zellen in fünf Millilitern des gleichen Mediums, das für die Kultur verwendet wird, auf ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern.
Als nächstes übertragen Sie die Zellen auf Eis und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das Pellet zweimal gewaschen haben, drehen Sie die Zellen erneut nach unten und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 150 Mikroliter frisch zubereitetem achtmolaren Harnstoff und 50-Millimolar Ammoniumbicarbonat-Lysepuffer wieder suspendieren. Mischen Sie den Inhalt des Rohres, indem Sie es nach oben und unten pipettieren.
Aliquot 50 Mikrogramm der Proteinprobe in ein neues Röhrchen und bringt Proben auf gleiche Volumina mit Lysepuffer. Dann Dithiothreitol zu einer Endkonzentration von 20-Millimolar in das Röhrchen geben und die Probe bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit Schütteln inkubieren. Lassen Sie die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie Jodoacetamid zu einer Endkonzentration von 40 Millimolar hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Dann verdünnen Sie die Probe mit einem 50-Millimollar-Ammoniumbicarbonat-Puffer auf unter einmolaren Harnstoff. Fügen Sie ein Mikrogramm Trypsin für 50 Mikrogramm Startprotein oder bei 1: 50 Trypsin zu Protein-Verhältnis zur Probe hinzu. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, um Proteine zu Peptiden zu verdauen.
Am nächsten Tag fügen Sie Ameisensäure zu 1% Volumen der Probe hinzu, um die Proteinverdauung zu stoppen. Für die Probenreinigung legen Sie eine Festphasen-Extraktionspatrone auf einen Vakuumverteiler, wobei Sie für jede Probe eine Extraktionspatrone gemäß den Richtlinien des Herstellers verwenden. Nach der Extraktion die Peptidproben aus dem Vakuumverteiler entnehmen und in einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen.
Die Trocknung dauert etwa drei Stunden. Für die Massenspektrometrie oder MS-Analyse resuspendiert die Peptidprobe in einer Konzentration von 400 Nanogramm pro Mikroliter in einem 0,2% Ameisensäurepuffer. Um die Peptide aufzulösen, mischen Sie die Probe fünf Minuten lang.
Dann beschallen Sie fünf Minuten lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät. Dann zentrifugieren Sie die Probe, um die unlöslichen Materialien zu pelletieren und die Peptidüberstände in MS-Fläschchen zu übertragen. Reichen Sie die Proben für die proteomische Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie oder LC-MS-MS ein.
Verwenden Sie die Einstellungen, die für die ungezielte Analyse durch die Massenspektrometrie empfohlen werden. Laden Sie die Proben auf eine analytische Säule mit einer Durchflussrate von 400 Nanolitern pro Minute, um die Peptide über einen 90-minütigen linearen Gradienten mit einer Mischung aus organischen und anorganischen Lösungsmitteln zu eluieren, wobei das organische Lösungsmittel zwischen 5 und 35 % liegt. Erfassen Sie Massenspektrometriedaten im datenabhängigen Modus mit einem kontinuierlichen Zyklus von MS1-Survey-Scans, gefolgt von 20 datenabhängigen MS2-Scans mit HCD-Fragmentierung. Quantifizieren Sie die Peptid-Peak-Bereiche für schwere und leichte Peptide im Proteome Quantitation-Softwaretool.
Exportieren Sie dann die schweren und leichten Peptid-Peak-Bereiche. Für die Berechnung der Protein-Halbwertszeiten öffnen Sie die SILAC-Analyse-Arbeitsmappe zum ersten Blatt mit dem Namen Raw Data und fügen Sie die UniProt-IDs, Gennamen, schweren und leichten Peakbereiche in die angegebenen Spalten ein. Öffnen Sie dann das vierte Blatt mit dem Namen Analyse, und entfernen Sie die Zeilen, in denen die Spalten G und H angeben, dass sich das Beispiel außerhalb des Bereichs befindet, und behalten Sie Zeilen, die innerhalb des Bereichs lesen.
Die seneszenten Phänotypen wurden mit Hilfe der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase-Aktivität und der RT-qPCR-Analyse validiert. Für die Beta-Galactosidase-Aktivität erschienen die seneszenten Zellen blau, während die ruhenden Kontrollzellen keine oder nur eine minimale Farbe hatten. In der RT-qPCR-Analyse zeigten die seneszenten Zellen höhere Interleukin-6-, CXCL8- und CDKN1A-P21-mRNAs im Vergleich zu den ruhenden Zellen.
Umgekehrt war der Gehalt an Lamin B1, das für den Proliferationsmarker kodiert, in den seneszenten Zellen niedrig oder fehlte. Die extrahierten Ionenchromatogramme von Peptiden zeigten den relativen Anteil schwerer und leichter Peptidsignale. Ein geringerer Anteil schwerer Peptidsignale im Vergleich zu leicht seneszenten Zellen deutete auf eine langsamere Proteinumsatzrate hin, und ein höheres schweres Peptidsignal im Vergleich zu Licht zeigte eine schnellere Proteinumsatzrate an.
Die unmarkierten Proben zeigten wenig oder kein schweres Peptidsignal. Die Halbwertszeiten für 695 Proteine, die aus der massenspektrometrischen Analyse identifiziert wurden, wurden berechnet. Die Halbwertszeit wird als Log-Zwei-Verhältnis von seneszenten über ruhenden Zellen berichtet und in einem Vulkandiagramm aufgetragen.
Nach der Berechnung der Proteinumschlagsraten in seneszenten Zellen kann die nachgelagerte Analyse mögliche biologische Signalwege aufdecken, die durch Proteostasemechanismen reguliert werden. Pulse SILAC ebnete den Weg für Forscher, die Proteindynamik mit beispielloser Granularität und Durchsatz zu untersuchen, so dass wir Veränderungen in der Proteinhomöostase in vielen einzelnen Proteinen untersuchen konnten.
