Diese Methode bietet eine effiziente Strategie zur Vorbereitung funktioneller Gerüste für die Knochentumorforschung. Dezellularisierte die Knochen-Extracelullar-Matrix, zeigte eine variable Serokompatibilität für das Überleben und die Aktivitäten von Osteosarkomzellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Osteosarkomzellenkultur in der Knochenmatrix eine hochheterogene Morphologie aufweisen, die einer klinischen Osteosarkom-Histopathologie ähnelt.
Die Methode bietet ein ideales Modell für die Untersuchung der Entwicklung, Progression von Medikamentenempfindlichkeiten von Knochentumoren, wie Osteosarkom, Ewing-Sarkom, und die anderen bösartigen Tumoren Metastasierung auf Knochen. Um zu beginnen, erhalten Sie vier bis sechs Wochen alte BALB/c-Mäuse, nachdem Sie eine Maus mit einer sterilen chirurgischen Schere eingeschläfert haben, schneiden Sie frische Fibel, Tibia und Oberschenkelknochen von einem Hinterglied ab. Mit Hilfe einer Pinzette, schälen Sie das Epithelgewebe, und entfernen Sie dann so viel des Weichgewebes wie möglich.
Spülen Sie die Beinknochen mit steriler 10 mM PBS-Lösung zweimal, um Blut in einer Sechs-Zentimeter-Schale zu entfernen. Die Knochen drei Minuten lang in eine Schüssel mit 75% Ethanol eintauchen und dann zweimal mit PBS abspülen. Bewahren Sie die sauberen Knochen in einem sterilen 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit sterilem PBS-Rohr bei 80 Grad Celsius auf.
Die gefrorenen Knochen bei Raumtemperatur auftauen und dann eine Stunde lang wieder bei 80 Grad Celsius einfrieren. Unterwerfen Sie die Knochen mehr als zwei Frost-Tau-Zyklen für Zelllyse und Gewebeabbau. Legen Sie die Knochen dann in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenrohr, das mit 0,5 normalem HCl gefüllt ist, und bebrüten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker mit sanftem Schütteln, um eine vollständige und gleichmäßige Abdeckung der Knochen zu gewährleisten.
Nach der Entkalkung die Salzsäurelösung vollständig dekantieren und die Knochen eine Stunde lang unter fließendem Wasser abspülen. Verwenden Sie dann destilliertes Wasser, um die Knochen zweimal für 15 Minuten pro Wäsche auf einem Orbital-Shaker zu waschen. Die Lösung wird vollständig dekant.
Um die Lipide in einem demineralisierten Knochen zu extrahieren, legen Sie die Knochen in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit einer 1:1 Mischung aus Methanol und Chloroform. Wickeln Sie das Rohr mit Zinnfolie, um Licht zur Vermeidung von Chloroformzersetzung zu vermeiden. Und legen Sie die Röhre auf einen Orbital-Shaker für eine Stunde.
Dann verwenden Pinzette, um die Knochen in eine andere Röhre von Methanol mit Zinnfolie für 30 Minuten zu übertragen. Entfernen Sie das Methanol vollständig, und waschen Sie mit destilliertem Wasser zweimal für 15 Minuten auf einem Orbital-Shaker. Decant endwash wasser und gehen Sie unter sterilem Zustand.
Spülen Sie die Knochen in einer sechs Zentimeter großen Schale mit sterilem PBS für drei Minuten. 40 Milliliter sterile 0,05%TE-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr geben und Knochen 23 Stunden lang in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entsorgen Sie die TE-Lösung und spülen Sie sie zweimal mit sterilem PBS, ergänzt mit 90 g/ml Ampicillin und 90 g/ml Kanamycin, für jeweils 15 Minuten auf dem Orbitalshaker.
Nach der dekantigen Endwäsche mit 40 Millilitern sterilem PBS wieder mit Antibiotika auffüllen. Waschen Sie gründlich für 24 Stunden bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln, um eine effektive Sterilisation von porösen Räumen zu erreichen. Dann übertragen Sie die Knochen in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit sterilen PBS mit Antibiotika gefüllt.
Die vorbereitete Knochen-Extrazelluläre Matrix kann zwei Monate lang bei vier Grad Celsius gelagert werden. BEM in 75% Ethanol in eine Schüssel eintauchen und das Gericht 30 Sekunden lang vorsichtig von Hand schütteln. Dann mit PBS für 30 Sekunden spülen, zweimal.
Übertragen Sie das BEM auf eine saubere Sechs-Well-Zell-Kulturplatte. Fügen Sie zwei Milliliter komplettes Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu. Bebrüte das BEM über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Erhalten Sie menschliche OS-Zelllinien in 100 Mikroliter vorgewärmten PBS mit Indikator Phenol rot. Verwenden Sie eine Pipette, um OS-Zellen mit der ungefähren Konzentration von 1 mal 10 bis 5 auszusetzen. Nachdem das BEM vollständig in das Medium eingeweicht ist, von proximalen oder distalen Epiphysen, durchbohren Sie die Nadel bis zur medullären Höhle von BEM und injizieren OS-Zellen in BEM.
Inkubieren Sie das OS-BEM-Modell für mindestens zwei Stunden in einer befeuchteten 5%Kohlendioxid-Atmosphäre bei 37 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die injizierten Zellen fest an BEM haften. Dann nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Fügen Sie ein Milliliter-Kulturmedium auf die Platte und halten Sie es über Nacht im Inkubator auf, um die Oberfläche der BEM-Kultur vollständig zu beschichten.
Das OS-BEM-Modell vorsichtig in einen neuen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit steriler Pinzette übertragen und einen Milliliter frischen Kulturmedium nachfüttern. Kultur das Modell für 14 Tage im Inkubator. Während der 14-tägigen Inkubation halten Sie die überwachung der mittleren Farbe.
Wenn das Medium in Orange oder sogar gelb umgewandelt wird, erfrischen Sie das Medium sofort, indem Sie die Hälfte des alten Mediums verwerfen und ein neues Medium hinzufügen, um eine gesunde Umgebung für Betriebssystemzellen zu erhalten. Halten Sie den Zellstatus unter dem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Wenn OS-Zellen auf Platte ausdehnen, übertragen Sie das OS-BEM-Modell vorsichtig auf einen anderen neuen Brunnen mit steriler Pinzette.
Spülen Sie das OS-BEM-Modell nach 14 Tagen vorsichtig mit PBS ab, um das Kulturmedium zu entfernen. Dann in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr übertragen und 10% gepuffertes Formalin hinzufügen, um es für die histologische Identifizierung zu beheben. Nach der Demineralisation und Dezellularisierung scheint BEM lichtdurchlässig mit stärkerer Belastbarkeit und Zähigkeit im Vergleich zu nativen Mausknochen zu sein.
Ein kleiner Muskelrückstand im Raum der medullären Höhle kann deutlich beobachtet werden. Die Hellfeld-Bildgebung des nativen Knochens und des dezellularisierten BEM zeigt die gründliche Entfernung von Zellkernen. Die natürliche poröse Struktur in kollagene Netzwerkanordnung ist gut in dezellularisiertebe BEM gepflegt.
Zusätzlich zeigt die immunhistochemische Färbung für Kollagen I und Kollagen IV, dass die Hauptbestandteile der extrazellulären Matrix nach der Dezellularisierung in Maustibia konserviert werden. Während der 14-Tage-Kultur werden periosteum und Endosteum durch die Ausdehnung von OS-Zellen infiltriert. OS-Zellen auf dem dezellularisierten BEM zeigen eine hochheterogene Morphologie, die den zytopathologischen Merkmalen eines OS-Abschnitts ähnelt.
Immunhistochemische Analysen nach 14 Tagen Kultivierung im BEM-Modell zeigen große Vorteile in Langzeitkulturen. Auch OS-Zellen und BEM-Kultur, hochexpress Bone Matrix Glykoprotein, die spezifisch für Osteoid-Matrix ist. Das dreidimensionale Modell dieses In-vitro-Modells wurde verwendet, um eine phänotyptische Heterogenität und einen regulatorischen Mechanismus der Osteosarkom-Dedifferenzierung mit Erfolg zu demonstrieren.
