Unser Protokoll bietet eine verbesserte Verifikationsmethode für Zirkulationschimäre und eine Methode für eine erfolgreiche Parabiose-Modelleinrichtung für die biomedizinische Forschung. Im Vergleich zu bestehenden Methoden zum Nachweis von Blutchimismus bei Parabiose, die oft tödlich oder umständlich sind, ist unser Protokoll sicher und einfach, was eine schnelle und zuverlässige Überprüfung ermöglicht. Obwohl diese Methode spezifisch für den Nachweis von Blutchimärein in Parabiose-Modellen ist, kann sie auf alle biomedizinischen Studien mit parabiotischen Verfahren angewendet werden.
Der schwierigste Schritt ist die Glukoseinjektion. Daher achten Sie darauf, die Schwanzveneninjektion zu üben, bevor Sie ein experimentelles Verfahren durchführen, oder verwenden Sie einen venösen visuellen Mausschwanzfixator. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Pedalreflex, platzieren Sie zwei 20 bis 25-Gramm-Beästhesoniert C57 schwarz 6 männliche Mäuse in der Rückenposition, und verwenden Sie einen elektrischen Rasierer gründlich rasieren die linke Seite einer Maus und die rechte Seite der zweiten Maus von etwa einem Zentimeter über dem Ellenbogen bis zu einem Zentimeter unter dem Knie.
Entfernen Sie alle verbleibenden Haare mit Enthaarungscreme, bevor Sie Längshauteinschnitte in der gereinigten Haut jedes Tieres machen, beginnend von 0,5 Zentimetern über dem Ellenbogen bis 0,5 Zentimeter unter dem Kniegelenk, und lösen Sie die Haut sanft von der subkutanen Faszie. Verbinden Sie das Olecranon und das Knie des Parabionts mit 3-0 Naht, und verschließen Sie die rasierte Haut mit einer kontinuierlichen 5-0 Naht. Dann subkutan injizieren 0,5 Milliliter 0,9%Natriumchlorid, um Dehydrierung zu verhindern, und intramuskulär injizieren 10 Milligramm Tramadol pro 25 Gramm Maus, um Schmerzen zu lindern, in jede Maus pro Tag für drei Tage.
Um den erfolgreichen Aufbau des Kreislaufs zwischen Denrimismus zwischen Parabionten durch Glukosefluktuation zu überprüfen, am 10. Tag nach der Parabiose-Operation, sichern Sie die Spendermäuse in einem venösen visuellen Mausschwanzfixator und verwenden Sie eine 70 bis 75% ethanolgetränkte Baumwollkugel, um die kaudalen Venen in der Flanke eines parabionten Schwanzes zu reiben. Legen Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel zwei bis vier Zentimeter von der Schwanzspitze und so parallel zur Vene wie möglich in die kaudale Vene ein und injizieren Sie dem Spender bei einem Zeitraum von 10 Sekunden ein bis zwei Gramm pro Kilogramm Glukose in 100 Mikroliter Salinelösung. Als nächstes verwenden Sie scheren, um die Zehen von den Spender- und Empfängertieren zu entfernen, um die Entnahme eines Tropfens Blut zu verschiedenen Zeitpunkten von Interesse nach der Injektion zu ermöglichen.
Fügen Sie dann einen Tropfen jeder Blutprobe in die Mitte eines Glucometer-Teststreifens für die Nachweisung des Glukosespiegels hinzu. Um die erfolgreiche Konstruktion der Zirkulation durch Evans Blaufarbstoffabsorption zu überprüfen, injizieren Sie 200 Mikroliter 0,5%Evans blauer Gegenfärbung intraperitoneally in die Spendermaus und sammeln Sie Blut von beiden Parabionten durch Herzpunktion nach zwei Stunden. Trennen Sie das Serum durch Zentrifugation, und übertragen Sie das Serum in ein konisches Rohr zur Verdünnung im Verhältnis eins zu 50 in 0,9% Natriumchlorid.
Messen Sie dann die Absorption der verdünnten Serumproben mit 620 Nanometern auf einem Spektralphotometer. In dieser repräsentativen Analyse des Blutzuckerspiegels bei sechs Spendermäusen erhöhte sich der Blutzucker spiegelauf in durchschnittlich einer Minute nach der Injektion von 100 Mikroliter Glukose durch die Schwanzvene deutlich auf 26,5 Mikromolar pro Liter. Der Blutzuckerspiegel sank dann nach und nach auf 13,3 Mikroliter pro Liter bei 60 Minuten.
Bei Empfängermäusen erhöhte sich der Blutzucker nach der Injektion langsam und erreichte den ersten Spitzenwert bei 15 Minuten. Die Konzentration von Evans Blaufarbstoff im Serum von Parabionten deutete auch auf eine erfolgreiche Konstruktion des Zirkulationschimmers hin, und subkutane Gefäßverbindungen zwischen den Parabionten konnten deutlich beobachtet werden. Bei Parabionten, die 15 Tage nach der Parabiose-Operation keinen Blutchimmelismus festgestellt haben, zeigten die Empfängermäuse innerhalb von 60 Minuten nach der Glukoseinjektion in das Spendertier keinen erhöhten Blutzuckerspiegel.
Die Blutkonzentration von Evans blue bei den beiden Empfängern war ebenfalls nicht erhöht, was zeigt, dass die Glukosefluktuationsmethode so empfindlich ist wie die Evans Blue-Methode. Darüber hinaus wurde der Insulinspiegel im Blut eine Stunde nach der Glukoseinjektion aufgrund des schnell erhöhten Glukosespiegels deutlich gesenkt und um drei Stunden auf ein normales Niveau zurückgewonnen, was darauf hindeutet, dass die Auswirkungen der injizierten Glukose auf den Insulinstoffwechsel wiederherspräparierbar sind. Achten Sie darauf, dass die Nadel direkt in die Schwanzvene eingeführt wird.
Nach der Bestätigung des Blutchimmers der Parabionten durch diese Methode können physiopathologische Veränderungen bei lebenden parabiotischen Tieren untersucht werden.
