Wir danken Virginia Doherty und Junmei Yao für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von NIMH (R01 MH084966) und der US Army Research Office und der Defense Advanced Research Projects Agency finanziert (gewähren W911NF-10-1-0059) bis KAG.

Alle Experimente wurden unter Verwendung von ausgewachsenen männlichen Long-Evans-Ratten durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee des Massachusetts Institute of Technology und der Animal Care und Verwenden schreiben Amt zugelassener die USAMRMC. 1. Vorbereitung <ol><li> Heparinise der Katheter und der Spritze, indem das abgeschirmte Nadel in einer 500 ul Röhrchen mit Heparin (1000 USP-Einheiten / ml) und dann Ansaugen und Ausstoßen von Heparin-Lösung durch die Nadel. <ol><li> Bringen Sie einen Schmetterling Katheter an der Spritze. Halten Sie das Schild über der Nadel des Katheters, um die scharfe Spitze vor Beschädigungen zu schützen. </li><li> Zurückzuziehen ein Volumen von Heparin, der etwas größer als das Volumen des Blutes, das gesammelt werden soll. Trennen Sie die Spritze und füllen Sie es mit Luft. </li><li> Bringen Sie die Spritze mit dem Katheter und verwenden Sie dieLuft, um überschüssige Heparin-Lösung zu vertreiben; sicherzustellen, nur Spuren in der Rohrleitung, Nadel und Spritze bleiben. </li><li> Legen Sie die sterile Katheter, mit der Spritze noch angebracht, auf eine sterile Oberfläche. </li></ol></li><li> Sichern Sie schnell die Ratte in einem sauberen Tuch um sicherzustellen, dass Vorder- und Hinterpfoten sind in einer komfortablen Position und Atmung ist nicht beschränkt. <ol><li> Sichern Sie den Wrap mit Klettband; sicherzustellen, dass äußeren Genitalien sind nicht eingeschnürt. </li><li> Einen Assistenten sanft und fest zurückhalten die Ratte (Bauch und Rutenansatz) auf einer festen Arbeitsfläche mit der Schwanz hängen über den Rand des Zählers. </li></ol></li></ol> 2. Blutentnahme <ol><li> Tauchen Sie das Heck in 42 ° C Wasser für 40-50 Sek Blutgefäße erweitern und trocknen Sie den Schwanz mit einem Papiertuch. Suchen Sie die Schwanzvene entlüftet werden (drehen Sie den ganzen Körper mit dem Schwanz verdrehen den Schwanz zu verhindern). Hinweis: Eine ausreichende Erwärmung des Schwanzes ist entscheidend für die rasche collection einer Blutprobe. Wenn der Gefäß verengt ist, ist die richtige Plazierung des Katheters schwierig, und der Blutfluss in beträchtlichem Ausmaß verringert. Heizkissen kann als Alternative zum Eintauchen in Wasser verwendet werden. </li><li> Identifizieren Sie die Entnahmestelle. Anmerkung: Die Arterie liegt entlang der Mitte der dorsalen Seite des Schwanzes; verwenden Sie nicht diese für die Probenahme. <ol><li> Ziel entweder die linke und rechte Schwanzvenen, die lateral der Arterie liegen. Pigmentierung der Schwanz, der durch den Stamm variiert und mit dem Alter zunimmt, kann ein Teil des Gefäßsystems zu verdunkeln. Ziel einen Abschnitt der Vene in dem unteren Abschnitt des Schwanzes. </li><li> Wischen Sie den Zielbereich mit 2% Chlorhexidin antiseptischen Lösung. </li></ol></li><li> Erzeugen Unterdruck in der Spritze und dem Katheter durch Herausziehen des Kolbens von Null bis ungefähr 50 &amp; mgr; l. </li><li> Halten Sie den Schwanz sanft und fest in der Nähe der Spitze, um den Schwanz gerade ganzen Probensammlung zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Blutfluss nicht durch eine zu enge Griff verschlossen.</li><li> Langsam setzen Sie den Katheter in die Vene in einem flachen Winkel von ungefähr 5 cm von der Schwanzspitze. Wenn die Vene eingedrungen ist, wird Blut in den Katheter fließt. Ziehen Sie langsam den Kolben der Spritze zu sammeln Sie die gewünschte Lautstärke mit einer konstanten Rate (~ 20 &amp; mgr; l pro Sekunde). <ol><li> Wenden Sie sich an Tierärzten für Informationen über die maximale Blutvolumen, die gesammelt werden können. Die maximale Blutmenge, die gesammelt werden soll, hängt von dem Gewicht und dem Gesundheitszustand der Ratte. Mehr als 15% der Gesamtblutvolumen in einem Zeitraum von 14 Tagen widerrufen Sie nicht. Hinweis: Das Blut ist viel schwieriger, von Tieren, die akut in den Minuten vor der Proben weil Stresshormone verengen die Gefäße betont wurden zu sammeln. Zum Beispiel bewegt Heimkäfig der Ratte auf ein neues Zimmer, wobei einige Minuten, um das Tier, oder wiederholte Einführen des Katheters in eine Vene wickeln werden wahrscheinlich eine akute Stressreaktion auslösen. </li><li> Erleichtern blood Fluss durch &quot;Melken&quot; der Vene. Führen einen Finger entlang der Länge der Vene von der Basis zur Spitze des Schwanzes, bleiben jedoch mehr als 2 cm von der Spitze des eingesteckten Nadel oder des Katheters kann abgelöste aus der Vene zu werden. </li><li> Wenn Blut nicht erfolgreich von der ersten Seite des Katheters Eindringen gesammelt werden, weitere Wieder führen Sie die Nadel bis die Vene. Wenn Blut wurde in der Anfangs Website gesammelt, re-Druck die Nadel durch Trennen und anschließendem Verbinden des Katheters und Spritze vor dem Wiedereinsetzen in die Vene. In der Regel vermeiden, zusätzliche Durchführungen. </li><li> Wie mehrere Durchdringungen können Schwanzvene Zusammenbruch, in dem die Blutversorgung der Schwanz abgeschnitten und die weiche Schwanzgewebe wird nekrotisiert verursachen, einschläfern die Ratte, wenn es Schwanzvene Zusammenbruch. </li></ol></li><li> Wenn eine ausreichende Probenmenge erhoben werden, freigeben Druck in der Spritze durch Trennen und Wiederverbinden des Katheters. Saugen Sie leicht mit dem Spritzenkolben (~ 50 &amp; #181; l), und die Nadel aus der Vene zurücktreten. Hinweis: Wenn die Nadel, ohne vorher die Druckentlastungs in die Spritze gezogen wird Blut von der Nadel tropft. </li><li> Druck auf die Einstichstelle kurzzeitig gelten die Blutung zu stoppen, und wischen Sie den Bereich mit antiseptischen Lösung. Gibt die Ratte in seinen Heimkäfig. </li></ol> 3. Verarbeitung der Blutprobe <ol><li> Saugen Luft, um sicherzustellen, kein Blut im Katheter Nadel bleibt, und mit einer Schere, um den Katheterschlauch direkt über der Nadel zu schneiden. Vertreibt das Blut in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Wenn das Blut durch die Nadel geschoben wird, kann die Scherkraft roten Blutkörperchen führen zu Bruch, die mit vielen stromabwärts Assays stören können. Entfernen Sie die Nadel, um eine Hämolyse zu vermeiden. <ol><li> Zu sammeln Blutplasma, Nutzung Rohre, die EDTA als Antikoagulans (hier enthalten, verwenden Sie 10 ul 0,1 M EDTA für 200-400 ul Blut; sicherzustellen, die Konzentration von EDTA verwendet wird, nicht stören wit der nachgeschalteten Test) und auf Eis. <ol><li> Spin Blutproben bei 2.100 × g in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) für 10 Minuten innerhalb von 10 Minuten der Sammlung. Elution des Plasmas, die Vermeidung der roten und weißen Blutzellschichten zu stören. </li></ol></li><li> Um Blutserum, Ort Proben (ohne Antikoagulans) bei Raumtemperatur für bis zu 30 min zu sammeln, um die Gerinnung zu ermöglichen. Dreh die Sammelröhrchen in einer Kühlzentrifuge (4ºC) bei 2000 x g. Das Serum kann dann eluiert werden. </li></ol></li><li> Verwenden Proben sofort oder bei -80 ° C für bis zu einem Jahr. </li></ol>

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	<li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction.">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li><li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps:+Systematic+Review.">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li><li>Chan, M. 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G., Yukhananov, R., Crosby, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+impairment+of+acquisition+of+a+spatial+memory+task+following+isoflurane-nitrous+oxide+anesthesia+in+rats.">Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats.</a> Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).</li><li>Vahl, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+ACTH+and+corticosterone+sampling+methods+in+rats.">Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).</li><li>Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+rats+with+various+behavioral+characteristics+during+acute+emotional+stress.">Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress.</a> Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).</li><li>McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+stress+hormones+in+health+and+disease:+Understanding+the+protective+and+damaging+effects+of+stress+and+stress+mediators.">Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators.</a> Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).</li><li>Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+norepinephrine+and+epinephrine+concentrations+in+adrenal+gland+of+the+rats+submitted+to+acute+immobilization+stress.">Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress.</a> Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).</li><li>Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ghrelin-growth+hormone+axis+drives+stress-induced+vulnerability+to+enhanced+fear.">A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear.</a> Mol Psychiatry. , (2013).</li><li>Knoll, A. T., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin,+stress,+and+depression.">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li><li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical/hippocampal+monoamines,+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder.">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir ein schnelles und einfaches Verfahren zur Aufnahme einer Blutprobe von einer Ratte, die gegenüber anderen üblicherweise verwendeten Techniken erhebliche Vorteile bietet erhalten wurde. Erstens erfordert sie keine Narkose im Gegensatz Probenahme aus der Jugularvene oder retroorbitalen Sinus. Wenn Blutproben gesammelt umgebenden Verhaltens Verfahren ist die Verabreichung von Anästhetika unerwünscht, da sie mit Lernen und Gedächtnis 4,5 stören. Zweitens bietet es die Möglichkeit, größeres Blutvolumen als andere Venenpunktionstechniken wie das Erheben von den Vena oder Rückenpedal Venen zu sammeln. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren bis zu 1,5 ml Blut können von einer Ratte an einem einzigen Zeitpunkt gesammelt werden, ein Volumen, das leicht ermöglicht mehrere Tests parallel ausgeführt werden. Schließlich minimiert dieses Verfahren das Potenzial für Gewebeschäden im Vergleich zu Amputation der Schwanzspitze oder retroorbitale Blutung. Die Verwendung dieses Verfahrens erleichtert die Einhaltung der Tier Welfare Act und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, die Minimierung der Schmerzen und Leiden, die von Laborverfahren an Tieren durchgeführt, führen müssen. Es wird empfohlen, dass die Ermittler neu in diesem Verfahren die Zurückhaltung zu üben und Schwanz Blutungen Techniken, um die Zeit, die Versuchstiere sind zurückhaltend zu minimieren. Blut in weniger als 3 min vom Beginn der Zurückhaltung gesammelt bietet optimale Ergebnisse. Das hier beschriebene Protokoll kann zum Abtasten 1-4 Mal pro Woche verwendet werden, aber nicht mehr als zweimal pro Tag. Während wiederholte Blutentnahmen durchgeführt werden, sollten verschiedene Messstellen, nach oben bewegt von der Basis des Schwanzes verwendet werden und die linken und rechten Schwanzvenen sollten Probenahmestellen abgewechselt werden. Das Gesamtblutvolumen von Nagetieren ist 6-7% ihres Körpergewichts, und nicht mehr als 15% des gesamten Blutvolumens innerhalb eines Zeitraum von 2 Wochen gesammelt werden. Serumoder Plasma enthält etwa 40-60% des gesammelten Probenvolumen. Blutentnahme über die seitlichen Schwanzvenen können auch in der Maus als hier mit einigen kleineren Modifikationen durchgeführt werden, beschrieben. Erstens können nur kleine Überdruck (27 G) Katheter verwendet werden. Zweitens ist es empfehlenswert, eine Rohrrückhalteeinrichtung zu verwenden, statt einer Verpackung, um die Mäuse zu immobilisieren. Das Volumen an Blut, die aus der Maus unter Verwendung der Venenpunktion der Unterkiefergefäßbündel (200-500 ul) erhalten werden kann, ist größer als sicher aus der Schwanzvene (200 ul maximal) gesammelt werden. Da Probenahme von Blut aus dem Unterkieferspeichelgefäßbündel erfordert minimale Zurückhaltung und kann mehr Blut zu erhalten, ist dies der bevorzugte Weg für die Probenahme in der Maus. Die Schnelligkeit, mit der dieses Verfahren durchgeführt werden kann, zusammen mit seiner minimal invasive Art, minimiert auch das Potential Störung der Blut basierenden Maßnahmen der akuten Stressreaktion 6. Dieakuter Stressantwort zirkulierenden Spiegel von vielen Molekülen, einschließlich Interleukinen und anderen Immun aktiven Faktoren 7, Hormone der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse 8, Hormone im sympathischen Nervensystem 9, Ghrelin 10, endogene Opioide 11, Dopamin zu ändern und Serotonin-12. Wenn Ruhe zirkulierenden Maßnahmen dieser Moleküle oder andere von diesen Molekülen reguliert erwünscht sind, ist es wichtig, die Stressreaktion, die innerhalb von weniger als einer Minute nach dem Beginn der Belichtung Stressor ausgelöst wird, zu minimieren. Stressreaktionen nicht nur die Zusammensetzung des Blutes verändern, sondern auch eine technische Hindernis zur Blutentnahme wegen der Verengung der Blutgefäße darstellen über erhöhte Fahrt vom sympathischen Nervensystems. Es wird schwierig, stetige Erhöhung des Blutflusses von einer Ratte, die Montage ist eine akute Stressreaktion zu erhalten. Daher muss das Tier Not minim seinized, um schnell zu erhalten Proben, die den physiologischen Zustand von Interesse zu reflektieren.

Biomarker aus dem Blut erhalten nützliche diagnostische, vorausschauende und Stratifizierung von Maßnahmen in vielen klinischen Zusammenhängen, einschließlich Herz-Kreislauf-Krankheit 1, Krebs Wissenschaften 2 und psychiatrische Erkrankungen 3. Sie können auch in der Grundlagenforschung verwendet, um den &quot;Zustand&quot; eines Organismus zu bewerten, einschließlich des Grades der Hunger, Entzündung oder vorhanden Stress werden. Solche Maßnahmen können durch Variablen, oder auch nicht entscheidend für die Frage von Interesse, darunter die Tageszeit, die die Probe erhalten wird, und das Geschlecht der Probanden sein kann beeinflusst werden. Es kann auch durch die Belastung während der Blutentnahme Verfahren selbst induzierten beeinflusst werden. Stresshormonen und die Wahrnehmung von Schmerz schnell verändern die Zusammensetzung des Blutes. Nagetiere sind die am häufigsten verwendeten Labortieren und mehrere Verfahren wurden für die Blutentnahme entwickelt. Die ideale Methode der Blutentnahme sollte minimal Physiologica habenl Einfluss auf das Tier, erfordert keine Narkose, erlauben eine schnelle und wiederholte Probenahme erfolgen, und eine ausreichende Blutmenge für zahlreiche Downstream-Anwendungen. Beliebte Techniken zum Sammeln von Blut, wie Katheterisierung der Halsschlagader oder Amputation der Schwanzspitze diese Kriterien nicht erfüllen. Das Ziel des Protokolls ist es, eine Blutentnahmetechnik zur Verwendung bei Ratten, die minimal belastenden beschreiben, erfordert keine Anästhesie, ermöglicht mehrere Blutsammlungen innerhalb eines einzelnen Subjekts, und eine relativ große Probenmenge, so dass mehrere Tests durchgeführt werden, an einer einzigen Probe. Das Ziel dieser Methode ist, um Blutproben, die minimal von der akuten Stressreaktion beeinflußt werden erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium heparin (1000 USP units/ml)</td>
			<td>Patternson Veterinary Supply</td>
			<td>25021040010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>JT Taylor</td>
			<td>JT2020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermachlor Rinse-Chlorhexadine</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>6356</td>
			<td>Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>TESV25BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin 1cc syringes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89202-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#956;l microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>21150-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, stainless steel, 5&#34;</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml plastic beaker</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>414004-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean cloth wrap</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velcro tape, .75&#34; width</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>B004AF9II6</td>
			<td>Hook and loop tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling blood from the lateral tail vein of the rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blutplasma von der lateralen Schwanzvene wie in dem Protokoll beschrieben gesammelt gibt eine Plasmaprobe, die durchscheinend hellgelb im Aussehen war. Wie in 1 gezeigt, Hämolyse in einer Probe vermittelt einen roten Farbton zu dem Plasma. Die akute Stressreaktion schnell verändern die Zusammensetzung des Blutes. Beispielsweise kann zirkulierenden Corticosteron Konzentration deutlich erhöht innerhalb von 10 min der Stressor Belichtung, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die niedrige basale Niveaus von Corticosteron bei diesem Verfahren vor der Belichtung Stressor erhalten zeigen, dass sich die Abtastung selbst nicht eine signifikante Quelle von Stress. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" /> Abb. 1: Beispielbild (A) A hämolysierten Probe gezeigt. Nach der Zentrifugation durch die schwarze ar angegeben das Plasma oder Serum Schicht (OberflächenReihe) erscheint mit rosa oder rot gefärbt. Dunklere Farbtöne zeigen ein höheres Maß an Hämolyse. (B) Nach der Zentrifugation wird eine einwand gesammelten Probe eine klare, gelbliche Erscheinung zum oberen Band (Oberfläche durch den schwarzen Pfeil angedeutet), die mit dem nicht-hämolysierten Plasma oder Serum entspricht. Beim Entfernen dieser Schicht ist es wichtig, um die zugrunde liegende Vollblut nicht stören, entweder, indem der Pipettenspitze in die Vollblut-Schicht oder durch Absaugen ein Teil des Vollbluts in die Spitze. Alle Plasma oder Serum mit Vollblut kontaminiert ist zu verwerfen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" /> Abbildung 2: Plasma-Corticosteron schnell Anschluss an eine stressige Erfahrung erhöhten Blut wurde aus der laterale Schwanzvene der erwachsenen weiblichen Long-Evans-Ratten vor erhalten und 10 Minuten nach Exposition mit 4 Tönen (10 sec, 2 kHz, 85 dB) Co-Abschluss. mit footshocks (1 sec, 350 &amp; mgr; A). Blutplasma Corticosteron zu Studienbeginn (290,4 ± 138,8 pg / ml) deutlich weniger als die Niveaus beobachtet 10 min nach Vorlage des Fußschock Stress war (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), geändert durch die gepaarten t bestimmt -test. *, P &lt;0,05

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Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

102.1K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology. Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Serie: Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

Drawing Blood von Ratten durch die Vena saphena und durch Herzpunktion

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Forschung

Biologie

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-Dissektion Rattenhirns RNA oder Protein Extraction von bestimmten Hirnregion

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Vorbereitung der Rattenschwanzsehnen für Biomechanik und Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Nicht-Terminal-Blut-Stichprobenverfahren bei Meerschweinchen

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for detecting the successful establishment of blood chimerism in parabionts by a caudal vein injection of glucose. Parabiotic mice were constructed. Glucose was injected into the donor mouse through the tail vein, and the fluctuation of blood glucose level was measured in both mice using a blood glucometer at different time points. Our results showed that after glucose injection, the blood glucose level in donor mice increased sharply after 1 min and decreased slowly thereafter. Meanwhile, the blood glucose level of the recipient mice peaked 15 min after injection. Similar results were obtained with Evans blue, used as a positive control for glucose. The synchronous fluctuation of blood glucose levels indicates that blood flow between the two mice was established successfully.

Here we describe a new method of detecting successful establishment of shared blood circulation of two parabionts through a caudal vein injection of glucose, which causes minimal damage and is not fatal to the parabionts.

Nachweis der gemeinsamen Blutversorgung bei parabiotischen Mäusen durch Kaudalenvene Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...