Erhöhung der Haltbarkeit dissoziierter neuronaler Zellkulturen unter Verwendung biologisch aktiver Korallenmatrix

Zusammenfassung

Die dissoziierte Hippocampus-Zellkultur ist ein zentrales experimentelles Werkzeug in den Neurowissenschaften. Das Überleben und die Funktion von Nervenzellen in Kultur werden aufgrund ihrer neuroprotektiven und neuromodulativen Rolle verbessert, wenn Korallenskelette als Matrizen verwendet werden. Daher zeigen Nervenzellen, die auf korallenartiger Matrix gezüchtet wurden, eine höhere Haltbarkeit und sind daher besser für die Kultivierung geeignet.

Zusammenfassung

Kulturen dissoziierter neuronaler und glialer Zellen im Hippocampus sind ein wertvolles experimentelles Modell zur Untersuchung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Funktion, da sie eine hohe Zellisolierung und eine kontrollierte Umgebung bieten. Das Überleben von Hippocampuszellen in vitro ist jedoch gefährdet: Die meisten Zellen sterben in der ersten Woche der Kultivierung ab. Es ist daher von großer Bedeutung, Wege zu finden, um die Haltbarkeit von Nervenzellen in Kultur zu erhöhen.

Calciumcarbonat in Form von kristallinem Aragonit, der aus dem Skelett von Korallen gewonnen wird, kann als überlegene, aktive Matrix für neuronale Kulturen verwendet werden. Durch die Pflege, den Schutz und die Aktivierung von Gliazellen verbessert das Korallenskelett das Überleben und Wachstum dieser Zellen in vitro besser als andere Matrices.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung von Hippocampuszellen auf einer korallenartigen Matrix. Diese Matrix wird erzeugt, indem Körner von Korallenskeletten an Kulturschalen, Flaschen und Glasdeckgläsern befestigt werden. Die Körner tragen dazu bei, die Umgebung der Zellen zu verbessern, indem sie sie in eine feine dreidimensionale (3D) Umgebung einführen, in der sie wachsen und gewebeähnliche Strukturen bilden können. Die 3D-Umgebung, die durch das Korallenskelett eingeführt wird, kann durch Schleifen für die Zellen optimiert werden, was die Kontrolle über die Größe und Dichte der Körner (d. h. die Matrixrauheit) ermöglicht, eine Eigenschaft, die nachweislich die Aktivität der Gliazellen beeinflusst. Darüber hinaus erleichtert die Verwendung von Körnern die Beobachtung und Analyse der Kulturen, insbesondere bei der Lichtmikroskopie. Daher enthält das Protokoll Verfahren zur Erzeugung und Optimierung der korallenartigen Matrix als Werkzeug zur Verbesserung der Erhaltung und Funktionalität von Nervenzellen in vitro.

Einleitung

Kulturen dissoziierter neuronaler Zellen, in diesem Fall Hippocampuszellen, sind ein wertvolles experimentelles Modell für die Untersuchung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Funktion, da sie eine hohe Zellisolierung und -zugänglichkeit bieten ^1,2,3. Diese Art von Kultur wird häufig in den Neurowissenschaften, in der Arzneimittelentwicklung und im Tissue Engineering verwendet, da eine große Menge an Informationen gesammelt werden kann, wie z. B. Wachstums- und Lebensfähigkeitsraten, Neurotoxizität, Neuritenwachstum und -vernetzung, synaptische Konnektivität und Plastizität, morphologische Modifikationen, Neuritenorganisation und -verdrahtung usw.1,4,5,6,7.

Trotz der Bedeutung der Kulturen werden die kultivierten Zellen in der Regel gezwungen, auf Glasdeckgläsern in einer zweidimensionalen Monoschicht zu wachsen. Diese strengen Umweltmodifikationen verringern die Überlebensfähigkeit von Nervenzellen im Laufe der Zeit erheblich, da Glasdeckgläser nicht nährende Substrate mit einer geringen Haftfestigkeit sind, die eine geringere Fähigkeit aufweisen, das Zellwachstum zu unterstützen 8,9,10,11.

Da kultivierte Nervenzellen gezwungen sind, unter schwierigen Bedingungen zu wachsen, wäre ein wesentlicher Ansatz, um ihr Überleben zu verbessern, ihre natürliche Umgebung so weit wie möglich zu imitieren^12,13. Dies könnte durch die Verwendung von Biomaterialien erreicht werden, die als Matrizen fungieren und die extrazelluläre Matrix der Zellen nachahmen, so dass sie eine gewebeähnliche Struktur bilden und ihre Ernährung unterstützen können¹⁴.

Die Verwendung von Biomaterialien ist ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung von Zellkulturen, da sie als biokompatible Gerüste fungieren, mechanische Stabilität bieten und eine Vielzahl von Zelleigenschaften verbessern, darunter Adhäsion, Überleben, Proliferation, Migration, Morphogenese und Differenzierung^15,16,17. Verschiedene Arten von Biomaterialien werden verwendet, um die Bedingungen der Zellen in vitro zu verbessern. Dazu gehören Biopolymere, also biologische Komponenten, die in der Regel Teil der extrazellulären Matrix der Zellen sind. Diese Biomaterialien werden meist als Form von polymerisierten Beschichtungsmitteln oder Hydrogelen verwendet^18,19,20. Einerseits bieten die oben genannten Matrizen den Zellen eine vertraute 3D-Umgebung, in der sie wachsen können, fördern ihre Adhäsion an der Schale und geben ihnen mechanische Unterstützung^21,22. Andererseits stört ihre polymerisierte Form und der Einschluss der Zellen in Hydrogele den Zugang der Zellen zu den in den Wachstumsmedien vorhandenen nährenden Bestandteilen und erschwert auch die Nachverfolgung der Zellen durch mikroskopische Methoden²³.

Korallen-Exoskelette sind biologische, aus dem Meer stammende Matrices. Sie bestehen aus Kalziumkarbonat, sind mechanisch stabil und biologisch abbaubar. Frühere Studien, in denen das Korallenskelett als Matrix für das Wachstum von Nervenzellen in Kultur verwendet wurde, haben im Vergleich zu Glasdeckgläsern eine viel größere Haftung gezeigt^24,25. Darüber hinaus zeigten Nervenzellen, die auf dem Korallenskelett gezüchtet wurden, ihre Fähigkeit, das Kalzium aufzunehmen, aus dem das Skelett besteht, was die Nervenzellen unter Bedingungen des Nährstoffmangels schützt²⁶. Darüber hinaus ist das Korallenskelett eine unterstützende und nährende Matrix, die das Überleben von Nervenzellen erhöht, die Bildung neuronaler Netzwerke fördert, die Rate der synaptischen Konnektivität erhöht und die Bildung gewebeähnlicher Strukturen ermöglicht^27,28. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Oberflächentopographie der Korallenskelettmatrix eine entscheidende Rolle bei der Verteilung und Aktivierung von Gliazellen spielt ^8,29. Das Korallenskelett eignet sich auch als Matrix für die Kultivierung anderer Zelltypen wie Osteozyten³⁰, ^31, Hepatozyten und Kardiomyozyten in Kultur (unveröffentlichte Daten).

Daher ist das Korallenskelett eine vielversprechende Matrix für die Kultivierung von Zellen in vitro. Daher beschreibt das unten beschriebene Protokoll die Technik der Kultivierung von Nervenzellen auf Korallenskeletten, um stabilere und erfolgreichere neuronale Kulturen zu erzeugen, als dies mit bestehenden Methoden erreicht wird. Dieses Protokoll kann auch für die Kultivierung von Kardiomyozyten, Hepatozyten und anderen Zelltypen nützlich sein.