Dieses Protokoll ist wichtig, weil es ein Modell für chronische Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion ohne die Notwendigkeit einer Fremdstoffimplantation oder Immunsuppression beschreibt. Verzögerte Impfung mit Pseudomonas aeruginosa 24 Stunden nach voller Dicke excisionalWunden prostalls die schnelle Clearance und Verbreitung der Bakterien, eine Infektion, die sieben bis zehn Tage dauert. Dieses einzigartige Modell wird ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der bakteriellen Pathogenese, Wirtspathogen-Wechselwirkungen und die Entwicklung neuer Therapien für chronische Pseudomonas aeruginosa Wundinfektionen sein.
Bei einer Demonstration des Eingriffs wird Dan Liu, ein Medizinstudent des Bollyky-Labors, dabei sein. Vor Beginn des Verfahrens, wiegen Sie eine anästhesierte acht bis 12 Wochen alte Maus, um ein Grundgewicht zu erhalten und die Maus in die anfällige Position zu legen. Nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex, subkutan injizieren Sie die Maus mit 250 Mikroliter vorgewärmt steril0,9% Natriumchlorid auf jeder Flanke.
Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um das Haar aus dem rückenden Bereich der Maus zu entfernen und eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die exponierte Haut aufzutragen. Nach 20 bis 60 Sekunden, entfernen Sie das Haar und überschüssige Lotion mit Gaze in warmem Wasser befeuchtet. Für eine volldicke exzistive Wundchirurgie verwenden Sie zunächst eine 25-Meter-Nadel, um 0,6 bis ein Milligramm pro Kilogramm anhaltendes Freisetzungsbuprenorphin im mittleren Dorsalbereich der Maus subkutan zu injizieren und die chirurgische Stelle mit drei alternativen sterilen Betadine- und Alkoholabstrichen kreisförmig abzuwischen.
Legen Sie einen Kunststoff-Klammer-Wrap-Drap über die chirurgische Stelle und dehnen Sie die Haut kauend straff. Wenn die Haut getrocknet ist, verwenden Sie einen sterilen Hautbiopsie-Punch mit sechs Millimetern Durchmesser, um einen ersten Schnitt durch die linke dorsale Epidermis zu machen, gefolgt von einem zweiten Schnitt auf der rechten dorsalen Epidermis. Verwenden Sie Zangen, um die Haut aus der Mitte des links umrissenen Wundbereichs zu zelten und verwenden Sie eine Schere, um die epidermalen und dermalen Schichten zu verbrauchen.
Nach dem Wiederholten des Schnittes auf der rechten umrissenen Wundfläche, um symmetrische Exzisionswunden zu erzeugen, waschen Sie beide Wunden mit 50 Mikroliter steriler Saline. Wenn die chirurgische Stelle und die umgebende Haut getrocknet sind, bedecken Sie die Wunden und dorsum mit einem transparenten Filmverband und legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. 24 Stunden nach der Operation die reanästhetisierte Maus erneut wiegen und das Tier subkutan mit 250 Mikrolitern vorgewärmten sterilen 0,9% Natriumchlorid in beiden Flanken injizieren.
Als nächstes laden Sie 100 Mikroliter der leuchtenden P.aeruginosa-Dehnungssuspension in eine 500-Mikroliter-Tuberkulin-Sicherheitskappenspritze, die mit einer 27-Spur-Nadel ausgestattet ist, und injizieren 40 Mikroliter Bakteriensuspension durch den transparenten Folienverband in jede Wunde. Stellen Sie sicher, dass die bakterielle Suspension gut gemischt ist und dass der transparente Verband intakt ist. Achten Sie darauf, dass Sie den transparenten Verband nur einmal mit der Nadellünette nach oben durchstechen.
Dann kehren Sie die Maus zu ihrem Käfig auf einer Heizseite mit Überwachung und bieten kalorienreiche Nahrungsergänzungsmittel Paste zwischen Lebensmittelpellets auf dem Boden des Käfigs eingeklemmt. Das restliche Inokulum auf einer LB-Agarplatte verkleben und die Kolonien zählen, um die Anzahl der verabreichten Bakterien zu bestätigen. Für die In-vivo-Bildgebung der infizierten Wunden folgen Sie den Biosicherheitsstufen zwei Containment-Protokolle für den Transport der Mäuse zum und vom Bildgebungsinstrument und platzieren sie die anästhesierte Maus in der anfälligen Position innerhalb der Bildgebungskammer.
Legen Sie in der Bildverarbeitungssoftware belichtungszeit, Binning, F-Stop und Sichtfeld als für das Experiment geeignet fest. Erstellen Sie als Nächstes eine Region, die an der Wundstelle von Interesse ist, und messen Sie den durchschnittlichen festgestellten Fluss in Photonen pro Sekunde. Um den Hintergrund zu messen, erstellen Sie einen Bereich von Interesse über einen zufälligen Bereich auf der Bildverarbeitungsplattform und subtrahieren Sie die Hintergrundanzahl der Photonen pro Sekunde.
Am Ende des Experiments, in einem Bio-Sicherheitsschrank, verwenden Sie sterile Schere und Zange, um die Wundbetten zu verbrauchen und legen Sie jedes Bett in einem Milliliter sterilen PBS in einem 1,5 Milliliter Polypropylen-Rohr. Schneiden Sie das Wundgewebe mit einer Schere und inkubieren Sie die Gewebestücke auf einem Shaker bei vier Grad Celsius in 300 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation wirbelt jede Röhre 10 Sekunden lang, bevor das bakterielle Abwasser in PBS seriell verdünnt und das verdünnte bakterielle Abwasser auf LB-Agar plattiert wird, um die bakterielle Belastung zu quantifizieren.
Dieses repräsentative Bild, das mit einem optischen Bildsystem gewonnen wurde, zeigt, dass dieses Modell zu einer nachweisbaren Lumineszenz führt. In diesem Experiment erreichte die Infektion ihren Höhepunkt am dritten Tag nach der Impfung und blieb sieben Tage nach der Impfung auf der Grundlage der Biolumineszenz- und Kolonieanzahl. Die Kultur der aus der Wunde isolierten Bakterien zeigt weiter, dass die quantifizierten Koloniebildenden Einheiten pro Wunde mit der nachgewiesenen Lumineszenz korrelieren.
Obwohl es eine erste schnelle Gewichtsabnahme unmittelbar nach der Injektion, Saline-Injektionen und zusätzliche Ernährung können die Mäuse zu ihren ursprünglichen Gewichten wiederherstellen. Die berechnete Impfdosis, von der 50% der Wunden im Wesentlichen infiziert werden, wurde als etwa 7,7-mal 10 bis zur zweiten Kolonie bildenden Einheiten pro Milliliter bestimmt. Dosen, die höher als ein mal 10 bis die vierte Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter führen zu einer 100%igen Infektionsrate.
Verschiedene topische und systemische Behandlungen können nach den Wund- und Impfverfahren angewendet werden, um neue mögliche Therapien für Pseudomonas aeruginosa zu untersuchen. Alle Arbeiten mit Pseudomonas aeruginosa und infizierten Mäusen sollten mit BSL-2 Sicherheitsvorkehrungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Forschers für die institutionelle Biosicherheit und den Einsatz von Tieren durchgeführt werden.
