Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen in der Pathogenese der infektiösen Endokarditis zu beantworten, und Pathobiogramme durch Felder wie das Zusammenspiel zwischen Bakterien, Blutzellen, und Endothelzellen Auskleidung Muskulatur. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Gewebetransplantate direkt gegenseitigen Wechselwirkungen mit verschiedenen Zielen ausgesetzt sein könnten, wie Bakterien, Thrombozyten und Proteine unter standardisierten Strömungsbedingungen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapie von infektiöser Endokarditis, weil sie wichtige molekulare Wechselwirkungen und Faktoren entwirren kann, die eine hohe Infektiosität bestimmter Gewebe antreiben.
Diese Methode gibt Einblick in die Pathogenese der Vegetationsbildung. Es kann auch in Studien zur Untersuchung der vaskulären Durchlässigkeit, Zellmobilität und Genzellexpression anwendbar sein. Um das Protokoll zu beginnen, legen Sie eine zuvor vorbereitete Gewebebiopsie mit einem Durchmesser von 10 Millimetern und der gleichen Dicke zwischen einem Mikroskopschlitten und einer kreisförmigen Perforation von acht Millimetern sowie eine Gummidichtung mit der nach oben gerichteten Innenfläche auf, um die bakterielle Suspension zu kontaktieren.
Konzentrieren Sie sich auf die Gewebetransplantatausrichtung, während Sie im Halter platziert werden. Stellen Sie sicher, dass die innere Oberfläche des Gewebes bereits der Blutbahn ausgesetzt ist, um Ihr experimentelles Medium zu kontaktieren. Als nächstes legen Sie Ihren Halter mit dem Gewebe in das Dichtungsblech ein, das in den unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.
Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit der entsprechenden Dichtungsfolie mit dem zuvor eingesetzten Gewebehalter an der Unterseite der Kammer. Dann montieren Sie die gesamte Kammer mit acht Schrauben und Schraubenmuttern. Stellen Sie sicher, dass die Kammerhöhe bei Transplantaten immer gleich ist, indem Sie einen Bremssattel oder ein Lineal verwenden.
Als nächstes verbinden Sie die Durchflusskammer mit einer peristaltischen Pumpe. Dann verbinden Sie das 400 Milliliter Flüssigkeitsreservoir mit den Rohren. Durchdringen Sie die Gewebe mit 100 Milliliter Suspensionen von zehn bis sieben fluoreszierend markierten Koloniebildenden Einheiten in Phosphat gepufferter Saline mit der schieren Spannung von drei Dines pro Quadratzentimeter und der entsprechenden Durchflussrate von vier Millilitern pro Minute für eine Stunde mit der peristaltischen Pumpe und dem Bakterienreservoir.
Rezirkulieren Sie kontinuierlich die 100 Milliliter bakterielle Suspension mit dem gleichen Sammelbehälter. Nach der Durchblutung die Kammer demontieren, um das Transplantat freizusetzen. Waschen Sie das Gewebestück zwei Mal mit vier MilliliterPBS in einer 12-Well-Platte mit einem Orbital-Shaker für drei Minuten.
Dann schneiden Sie den inneren Teil des Transplantats mit einem Hautbiopsie-Punch mit einem kleineren Durchmesser. Legen Sie jede Gewebebiopsie in eine separate 14-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid. Lösen Sie die Bakterien mit einem Beschallungsbad 10 Minuten lang aus dem Gewebe.
Bereiten Sie eine einzelne 14-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid vor, um serielle Verdünnungen der bakteriellen Suspension nach der Beschallung zu machen. Beschriften Sie das Rohr Nummer zwei. Bereiten Sie drei 14 Milliliter-Röhren mit 10 Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid für serielle Verdünnungen der anfänglichen bakteriellen Suspension vor, die zum Profusionsexperiment gebracht wurde.
Beschriften Sie die Rohre Nummer drei, Zahl vier und Nummer fünf. Als nächstes sichern Sie drei Agarplatten, eine für die bakterielle Perfusion, eine für die Kontrolle der Durchblutung von PBS und die dritte für die anfängliche bakterielle Suspension, die für Perfusionen verwendet wird. Beschriften Sie drei Sektoren pro Platte für das Gewebeexperiment auf folgende Weise: 10-1, 10-3 und 10-4.
Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in der bakteriellen Perfusing zu zählen, beschriften Sie die Platte wie folgt:10-1, 10-3, 10-5 und 10-7. Wirbeln Sie die Röhren, die die Gewebebiopsie enthalten, jeweils 15 Sekunden lang, um serielle Verdünnungen zu machen. Um die seriellen Verdünnungen vorzubereiten, übertragen Sie 100 Mikroliter des Rohres Nummer eins auf Rohr Nummer zwei, und wirbeln Sie das Rohr gründlich, um die Lösung gründlich zu mischen.
100 Mikroliter des Gehalts von Rohr Nummer eins und Zwei auf die entsprechenden Sektoren verteilen, 10-1 und 10-3 der Agarplatte. Dann verteilen 10 Mikroliter Rohr Nummer zwei auf Sektor 10 vier. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um vier separate Wuchse von jedem Volumen von 10 Mikrolitern zu erhalten.
Um serielle Verdünnungen der Anfangskultur vorzubereiten, wirbeln Sie zunächst die Verdünnung für 15 Sekunden aus und übertragen Sie 100 Mikroliter bakterielle Suspension auf Tube Nummer drei, und mischen Sie durch Wirbeln kräftig. 100 Mikroliter Rohr Nummer drei zu Rohr Nummer vier hinzufügen und erneut mischen. Wiederholen Sie den Vorgang für Rohr Nummer fünf aus Rohr Nummer vier.
Verteilen Sie 100 Mikroliter des Gehalts der Tuben Nummer drei, Zahl vier, Zahl fünf und der beschrifteten Anfangskultur auf die Sektoren 10-3, 10-5, 10-7 und 10-1 der Blut-Agarplatte. Lassen Sie die Blut-Agar-Platten unter der laminaren Haube, um die bakteriellen Ausbreitungen an der Luft zu trocknen, in der Regel für 10 Minuten. Danach die Teller bei 37 Grad Celsius für die nächtliche Inkubation aufstellen.
Zählen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Bakterienkolonien, um die Anzahl der KBE zu erhalten. Unter reinen Stressbedingungen wurde eine ähnliche bakterielle Anhaftung über die verschiedenen Transplantatgewebe sowohl bei Staphylococcus aureus als auch bei Staphylococcus epidermidis beobachtet. Im Anschluss an die Verfahren, Streptococcus sanguinis zeigte signifikante Verringerung der Haftung an der Rinder jugular Venenwand, im Vergleich zu den Rinder perikardium Patch.
Beim Vergleich der drei Bakterienarten stellt Streptococcus sanguinis eine signifikant geringere Haftung an der Rinderjugularvenenwand in Bezug auf Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis dar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, richtige Gewebe desselben Kopfes vorbereitet zu haben. Es wird ähnliche Bedingungen für alle Versuchsproben gewährleisten und die Datenvariabilität zwischen verschiedenen Versuchsreihen minimieren.
Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik den Forschern, die komplexen Störungssysteme Schritt für Schritt zu erforschen, indem sie ihre In-vitro-Modellansätze mit verschiedenen Elementen anreichern, um die volle Komplexität in der Nähe des medizinischen Status aufzubauen.
