Dieses Protokoll bietet detaillierte Skizzieren, wie zahnärztliche Zellstoffstammzellen mit trigeminalen Neuronen kokulturiert werden können. Mit ihm können wir mehrere Reaktionen untersuchen, die durch ihren Crosstalk angetrieben werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, entweder oder beide Zellpopulationen zu untersuchen und zu manipulieren und die Ergebnisse genau zu messen.
Diese Methode hat direkte Relevanz für die neuronale Forschung und könnte Einen Einblick in die Forschung darüber geben, wie Zellstoffstammzellen neuronales Gewebe reparieren, das durch traumatische Ereignisse oder neurodegenerative Erkrankungen geschädigt ist. Es gibt mehrere Stufen dieser Technik zu lernen und es kann schwierig sein, Trakt von allen zu halten. Dieses Protokoll beschreibt jede Phase, um dabei zu helfen.
Der Zellstoff und die Ganglien sind schwer zu dispergieren und erfordern verschiedene Wirbel und Pipetten. Selbst dann erhalten Sie nicht die vollständige Dispersion, so dass Optimierung und Replikationen erforderlich sind. Nach der Einschläferung der Maus, legen Sie den Kopf auf das Einweg-Unterpad, so dass der Mund zur Decke und die Basis des Halses ist flach auf der Arbeitsfläche.
Verwenden Sie eine Rasierklinge und eine Sägebewegung, um den Unterkiefer von der Maxilla zu trennen. Entfernen Sie die Zunge mit einer Schere oder Zange, um den Zugang zu den Molaren zu erleichtern. Legen Sie den offenen Kopf in die Schale auf einem sterilen Gazepad und legen Sie die Probe unter das Sezieren des Mikroskops.
Entfernen Sie das alveolare Knochengewebe, das die ersten Molaren umgibt. Setzen Sie Zangen in die Alveolaröffnung ein und necken Sie das Gewebe vom Zahn weg in Richtung der Buknebene oder der lingualen Seite des Mundes. Sammeln Sie alle oberkieferförmigen ersten Molaren und übertragen Sie die submandibulären und maxillären ersten Molaren vorsichtig auf eine separate Zellkulturschale mit 1X PBS auf Eis.
Entfernen Sie das Zahnschmelz-Außenorgan, das die Außenseite jedes Oberkiefers zuerst Molaren umgibt. Mit einer Reihe von Zangen drehen Sie den Mol, so dass die Spitzen nach unten und die offene Wurzel ausgesetzt ist. Es gibt eine ovale Öffnung auf der Unterseite des Zahnes und undurchsichtiges Zellstoffgewebe, das durch eine dünne Schicht aus Dentin und Zahnschmelz verkapselt ist.
Lösen Sie mit der Spitze der Zange vorsichtig den Zellstoff, indem Sie einen Arm der Zange um den inneren Umfang des mineralisierten Gewebes laufen lassen. Entfernen Sie das Zellstoffgewebe aus der mineralisierten Struktur und übertragen Sie es in eine dritte Schale, die 1X PBS enthält. Entfernen Sie das Schmelz-Außenorgan, wenn es nicht bereits getrennt war.
Übertragen Sie das gesamte Zellstoffgewebe auf 0,25%Trypsin EDTA in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Wirbeln Sie die Mischung und legen Sie es in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 10 Minuten. Unter einer sterilen Kapuze, fügen Sie erwärmte Co-Kultur-Medien zu einem endgültigen Verhältnis von mindestens eins zu eins Medien, um Trypsin zu versuchen, um das Enzym zu inaktivieren.
Pipetten Sie die Medien mehrmals mit einer 10 Milliliter Pipette nach oben und unten, um den Zellstoff in den Medien weiter zu dispergieren, große Blasen zu vermeiden. Übertragen Sie einen Milliliter des dispergierten Zahnfleisches auf jeden Brunnen mit 24-Well-Gewebekulturplatte. Legen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Und erlauben Sie den Zellen, sich 48 Stunden lang aus dem undispersen Gewebe zu befestigen und zu migrieren, bevor sie die Medien wechseln. Nach der Einschlämung und Entfernung der Haut, legen Sie die Spitze eines Paar Mikro-Sezieren Schere in die Basis des Schädels. Schneiden Sie entlang der sagittalen Naht des Schädels.
Machen Sie vier kleine horizontale Schnitte entlang der koronalen Nähte durch die Ohren bis entlang der Lambdoid Nähte der Basis des Schädels. Dadurch entstehen zwei Knochenklappen. Verwenden Sie die Zange, um die beiden Knochenklappen zurückzuschälen, um das Gehirn zu offenbaren.
Finden Sie die trigeminale Ganglien in der Dura mater zwischen dem Gehirn und Knochen des Kieferprozesses untergebracht. Schneiden Sie die drei Zweige, die zu den Augen, Maxillae und Unterkiefer reisen. Und verwenden Sie gerade Rand feine Zange, um die Ganglien auf kalte 1X PBS in einer Schüssel auf Eis zu übertragen.
Sobald alle trigeminalen Bündel geerntet werden, verwenden Sie File Zangen, um Ganglien in 50 Milliliter konische Röhre mit fünf Milligramm pro Milliliter steriler gefilterter Kollagennase Typ II zu übertragen. Alle fünf bis zehn Minuten die Röhre aus dem Wasserbad nehmen, Wirbel machen und ins Bad zurückkehren. Zentrifugieren Sie die Kollagenase trigeminale Neuronlösung für zwei Minuten bei 643xg.
Unter einer Gewebekulturhaube die Kollagenase vorsichtig mit einem Mikropipet ansaugen und fünf Milliliter 1%sterilgefiltertes Trypsin Typ II hinzufügen. Dann legen Sie das Rohr für 25 bis 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und innerhalb dieses Zeitrahmens wirbeln Sie das Rohr kurz alle fünf Minuten kurz aus. Fügen Sie Medien im Verhältnis von Trypsin zu Medien eins zu eins hinzu, um das verbleibende Trypsin zu deaktivieren. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verdünnen Sie die Mischung auf 200.000 Zellen pro Milliliter in Medien.
Beschichtete Transwell-Filter mit Zahnbrei in Brunnen geben. Pipetten Sie 250 Mikroliter auf den Transwell-Filter und kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius über Nacht. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Medien durch einen Milliliter Co-Kultur-Medien, ergänzt durch ein mikromolares Uridin und 15 Mikromolar 5-Fluor-2'deoxyuridin, um die Überproliferation von mesenchymalen Zellen zu stoppen, die ein Neuritenwachstum verhindern können.
Sie müssen mitotische Inhibitoren am zweiten Tag hinzufügen oder Neuritenwachstum wird nicht auftreten. In dieser Studie wurde das Trigeminale Neurritwachstum in Gegenwart von primären Zellstoffzellen im zugrunde liegenden Brunnen im Vergleich zur Kontrolle der trigeminalen Neuritmonokultur erhöht. Primärzellen, die vom TGF-Beta-Rezeptor 2-Flox/Flotx-Maus isoliert wurden, waren nach Injektionen von ade-Cre-GFP oder ade-eGFP zahlengleich.
Die semiquantitative PCR zeigt, dass das Adenovirus-Cre-GFP den flankierten Gen transformierenden Wachstumsfaktor Beta-Rezeptor 2 mit Adenovirus-eGFP als Kontrollvirusvektor löschte. In den Kulturen mit transformierendem Wachstumsfaktor Beta-Rezeptor 2 Deletion, Neuritenwachstum wurde verringert. Die Hellfeld-Bildgebung von Transwell-Filtern nach kristallvioletter Färbung von Zellpopulationen zeigt, dass große Poren weit verbreitet sind.
Der große Pfeil zeigt auf eine Zelle mit mesenchymaler Morphologie, während der kleine Pfeil auf eine Zelle der neuronalen Morphologie zeigt. Kristallviolett befleckt beide Zellen ohne Voreingenommenheit. Darüber hinaus zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Beta-III-Tubulin mit einem alexa 488 Sekundärantikörper eine unspezifische Färbung mehrerer Zellen, was die Bildgebung von affemittenten Strukturen erschwert.
Da sich weder Zahnstoffzellen noch Trigeminusneuronen leicht dispergieren, muss jeder Forscher seine Beschichtungsverfahren optimieren. Wenn Sie Zahnstoffzellen allein in separaten Brunnen kultiermitteln, können Sie Immunfluoreszenz verwenden oder RNA- oder Proteinspiegel quantifizieren, um zu bestimmen, wie die Zellstoffzellen der Zahnstoff auf die Neuronen reagieren. Denken Sie daran, alle Behälter oder Tipps zu bleichen, die in Kontakt mit Adenovirus kommen.
Achten Sie darauf, die Rasierer richtig in einem scharfen Behälter zu entsorgen.
