Wir danken Melissa Klocke für die Unterstützung der Vorbereitung Abbildung 1 und Anna Ratliff für den Nachweis des Protokolls. Diese Arbeit wurde von der Research Corporation for Science Advancement unterstützt.

Ein. Mikrotubuli Gliding Assay Stammlösungen Bereiten Sie vor der gleitenden Assay. <ol><li> Polymerisieren 0,5 mg Mikrotubuli spärlich mit hellen organischen Fluorophor 22 markiert. Die Zielmarke Konzentration 1 Fluorophors pro Mikrometer Mikrotubuli, oder eine Kennzeichnung Dichte von ungefähr 1 pro 1500 Fluorophor Tubulindimere. Lagerung bei Raumtemperatur, Licht mit Aluminium, Folie für bis zu zwei Wochen geschützt. </li><li> Entschlacken Biotin-Kinesin 21 bei etwa 1 uM. Lagerung bei -80 ° C in 5 ul Aliquots für den Einsatz in einzelnen Experimenten. </li><li> Bereiten Sie die Assaypuffer (AB) von 50 mM imidiazole, 50 mM Kaliumchlorid (KCl), 4 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2), 2 mM Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA), pH 6,7. Sterile Filter und bei 4 ° C. </li><li> Aufzulösen biotinylierten Rinderserumalbumin (Biotin-BSA) und 2 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter.Lagerung bei -80 ° C in 100 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu einem Monat. </li><li> Aufzulösen Streptavidin (SA) zu 10 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 20 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu zwei Wochen. </li><li> Aufzulösen α-Casein bis 5 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 100 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu zwei Wochen. </li><li> Aufzulösen Dithiothreitol (DTT) in entionisiertem Wasser bei 200 mM. Lagerung bei -20 ° C in 100 ul Aliquots innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen verwenden. Kann wieder eingefroren werden. </li><li> Aufzulösen Paclitaxel (PT) in HPLC-Qualität Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 4 mM. Shop in 10 ul Aliquots bei -80 ° C langfristig -20 ° C kurzfristig. Verwenden Sie innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen. Kann wieder eingefroren werden. </li><li> Aufzulösen Glucose in deionisiertem Wasser bei 120 mg / ml. Shop in 100 ul Aliquots bei -20 ° C. Kann wieder eingefroren werden. </li><li> Dislösen Adenosintriphosphat (ATP) in entionisiertem Wasser auf 150 mM, pH 7,0. Shop in 5 ul Aliquots bei -80 ° C innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen verwenden. </li><li> Bereiten 100x sauerstoffabfangende Lager 25 durch Lösen 10.000 Einheiten Glucoseoxidase und 156.000 Einheiten Katalase in 600 ul Gesamtvolumen Assay-Puffer. Zentrifuge kurz in einer Mikrozentrifuge zu pelletieren Feststoffe, Filter Überstand mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 10 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li></ol> 2. Mikrotubuli Gliding Assay, Same Day Herstellung der Lösung Bereiten der Lösungen in 2,1 bis 2,6 am Tag des Experiments. Mit etwas Übung können Lösungen 2,2-2,6 während Durchflusszelle Waschen vorbereitet werden. Sofern nicht anders angegeben, halten Stammlösungen auf Eis. <ol><li> Bereiten AB, 1 ml Assay-Puffer mit 10 ul DTT Lager (AB mit 2 mM DTT). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten bio-BSA-Puffer, 40 &amp; mu; L einer 1:1-Mischung aus dem Biotin-BSA Lager und AB. Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Planen BSA-Puffer, 645 ul Mischen AB mit 5,5 ul BSA (1 mg / ml BSA in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten SA-Puffer, Mischen 57 ul der AB mit 3 ul Streptavidin Lager (0,5 mg / ml Streptavidin in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten α-Casein-Puffer, Mischen von 200 ul der BSA-Puffer, 50 ul Casein Lager, und 0,8 ul 15 uM ATP (1 mg / ml α-Casein, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Fluoreszenz anti-bleach-Puffer, Mischen von 95 ul α-Casein-Puffer, 2,5 ul Glucose-Lager, 1 ul 100x sauerstoffabfangende mix, 1 ul Paclitaxel Lager, 1 ul 2-Mercaptoethanol (βME). Fügen βME unter Abzug vornehmen. Verwenden Fluoreszenz anti-bleach Puffer innerhalb 1 Stunde der Vorbereitung. ACHTUNG: βME ist hochgiftig und riecht schrecklich. Achten Sie darauf, nur unter dem Abzug zu öffnen. Shop Flasche imAbwesenheit von Licht; Licht verschlechtert βME und seine Fähigkeit, Photobleichen reduzieren. </li></ol> 3. Mikrotubuli Gliding Assay <ol><li> Konstrukt etwa vier Fahrspuren Strömung zwischen einem 24 x 60 mm Deckglas und 22 x 22 mm Deckglas mit Vakuumfett, extrudiert aus einer Spritze durch eine Pipettenspitze, als Abstandshalter. Jede Flow lane sollte etwa 10 ul Volumen (Skala nachfolgenden Volumina entsprechend) sein. </li><li> Waschen 10 ul Bio-BSA-Puffer in jede Spur. Inkubieren 5 min zu ermöglichen BSA zur Beschichtung der Glasflächen. </li><li> Waschen Sie jede Spur dreimal mit 15 ul BSA-Puffer zu entfernen freiem Biotin-BSA, während sie weiterhin die Gleitfläche zu blockieren. Verwenden Sie einen Kimwipe oder Filterpapier, um Buffer von der gegenüberliegenden Seite des Flusses Kammer zu entfernen, wobei Sie nicht zu erlauben, Luftblasen durch die Flusskammer gehen. </li><li> Waschen 15 ul SA-Puffer in jede Spur. 10 min warten, oder bis zu 2 Stunden. Das Streptavidin an die Oberfläche gebundene Biotin-BSA zu binden. </li><li> Waschen Sie jede Spur dreimal mit 15 ul BSA-Puffer auf freie SA zu entfernen, während weiterhin die Gleitfläche zu blockieren. </li><li> Waschen Sie jede Spur mit 15 ul α-Casein-Puffer. α-Casein hilft weiter blockieren, nicht-spezifische Bindung von Kinesin und Mikrotubuli auf das Glas. </li><li> Verdünnen Kinesin bis 10 nM in α-Casein-Puffer waschen und jede Gasse mit 15 ul dieser Kinesin - α-Casein-Lösung. Warte 15 min (oder bis zu einer Stunde) für das biotinylierte Kinesin spezifisch an der Oberfläche gebundenen Streptavidin. Die Kinesin-Motor-Domänen bleibt frei zu binden Mikrotubuli. </li><li> Verdünnen Paclitaxel bis 40 uM in Raumtemperatur α-Casein-Puffer, und waschen Sie jede Spur mit 15 ul dieser Lösung zu waschen freien Kinesin und vorab geladen jede Strömungskammer mit einer Paclitaxel-Lösung Mikrotubuli aus Depolymerisation zu verhindern. Kalte auch depolymerisiert Mikrotubuli, so stellen Sie sicher, dass diese Schritte erfolgen bei Raumtemperatur mit Raum-temperaturre Lösungen. </li><li> Fluoreszenzmarkierten verdünnten Mikrotubuli 1:100-1:1,000 der Fluoreszenz anti-bleach-Puffer mit 1 mM ATP. Waschen 15 ul in einer Fahrspur und beobachten innerhalb von 30 min. </li></ol> 4. Data Collection <ol><li> Beachten Sie die Mikrotubuli Gleiten mittels Fluoreszenzmikroskopie, ein Mikroskop auflösen können einzelne Fluorophore wie einer gewerblichen oder home-build TIRF Setup 26 (Abbildung 2) erforderlich. Die Mikrotubuli sollte durch die Kinesin-Motoren über das Substrat werden bei etwa 0,5 &amp;mgr; m / s angetrieben, je nach Temperatur. Wenn das Feld-of-view des Mikroskops 50 um, sollten die einzelnen Mikrotubuli sichtbar sein für ca. 100 sek. Set Beleuchtungsstärke, so dass einzelne Fluorophore nicht schneller als 100 sec Photobleichmittels tun. Bei der Verwendung von Laser-Anregung, ist eine Leistungseinstellung von etwa 3-5 mW angemessen. </li><li> Collect Bildfolgen zur Analyse. 600 Bilder auf5 Hz (2 min gesamt) gut funktioniert. Verwenden Sequenzen lange genug, dass Mikrotubuli das gesamte Feld-of-view zu durchqueren. </li></ol> 5. Data Analysis Ein IDL-Routine, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , ist beigefügt. Diese Routine gibt eine Persistenzlänge Wert auf allen Mikrotubuli Gleiten in einem gegebenen Bild Sequenz. Entweder laufen diese Routine auf jeder Bildsequenz, Modifizieren Intensität Parameter je nach Ihren speziellen Mikroskop-Setup, oder führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Verfolgen Sie jedes Fluorophor an einem Mikrotubulus zu Fluorophor Trajektorien erstellen. </li><li> Vereinen alle Trajektorien von Fluorophoren auf einer gegebenen Mikrotubuli in ein Gesamtsystem Mikrotubulus Trajektorie; Wiederholung für jede Mikrotubuli in der Bildsequenz (Abbildung 3). </li><li> Berechnen den Tangentenwinkel an jedem Punkt entlang der Trajektorie (Abbildung 4)Und berechnen &lt;cos θ s&gt; in Gl. Ein durch Mittelung des Kosinus des Winkels Differenz für jedes Paar von Punkten durch eine Weglänge getrennt s (Abbildung 5). Finden Sie die Persistenzlänge für eine einzelne Mikrotubuli oder eine Gruppe von Mikrotubuli durch den Einbau &lt;cos θ s&gt; Gl. 1, Gewichten der einzelnen Datenpunkte in der Passung der Anzahl von unabhängigen Werten von cos θ s, mit dem der durchschnittliche berechnen sind. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Persistenzlänge Messungen sind eine gute Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Biopolymeren. In diesem Artikel, haben wir ein Verfahren zur Messung der Persistenzlänge Mikrotubuli beschrieben. Wie in der Einleitung erwähnt, wird dieses Verfahren ohne weiteres zu prüfen Mikrotubulus mechanischen Eigenschaften in einer Vielzahl von Bedingungen durch einfaches Variieren der Reagenzien, die Temperatur oder Viskosität im letzten Schritt der gleitenden Assay, 3.9, oder durch Polymerisation von Mi...

Das Zytoskelett, einem Netzwerk von Biopolymeren in den meisten eukaryotischen Zellen gefunden wird, spielt eine Rolle in der zellulären Organisation, den intrazellulären Transport und Zellmechanik. Die mechanischen Eigenschaften der Biopolymere des Cytoskeletts (primär Aktin und Mikrotubuli) spielen eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften der Zelle als Ganzes 12. Da Ganzzell Mechanik charakterisieren gesunden und kranken Zellen 13,14 und wird in zellulären Motilität 15 beteiligt sind, haben sich die mechanischen Eigenschaften der zugrundeliegenden Zytoskelett-Komponenten ein aktiver Bereich der Studie in den vergangenen zwei Jahrzehnten ein. Die Flexibilität (oder Steifigkeit) von Biopolymeren erhält Persistenzlänge kann die Länge des Polymers, welche Biegungen um etwa ein Bogenmaß unter thermischer Schwankungen bei Umgebungstemperatur ist. Eine Anzahl von Techniken entwickelt worden, um Persistenzlänge 16, zum Beispi messenle aktiven Techniken, die das Biegen des Polymers mit hydrodynamischen Fluss, optische Fallen, oder elektrische Felder 4,17,18 und passive Techniken, die die Schwankungen der freien Polymeren in Lösung 5,6 messen zu beteiligen. Die aktive Messungen erfordern jedoch spezielle Setups bekannten Kräfte im Mikrometerbereich zu implementieren und die freien Fluktuationsmessungen kann schwierig sein, durch Diffusion aus der Fokusebene des Mikroskops verwendet. In diesem Artikel beschreiben wir einen komplementären, passiv, Technik, um die Persistenz Länge der Mikrotubuli, ein Zytoskelett Polymers zu messen. Die Technik umfasst Gleiten Assays, was bedeutet, dass das Polymer bleibt immer in der Brennebene 19 sicherzustellen. Darüber hinaus ist es Tracking einzelnen Fluorophore dauerhaft mit dem Polymer von Interesse gebunden sind, so dass spezifische Stellen entlang der Polymer gut charakterisiert sind. Eine Karikatur des Verfahrens ist in Figur gezeigt,e 1. Kinesin bewegt speziell auf die + Ende der Mikrotubuli, so dass die Mikrotubuli in einem gleitenden Assays sind unidirektional angetrieben. Das führende Ende des Filaments, jenseits der letzten Kinesin befestigt, frei unter den thermischen Kräften der umgebenden Lösung schwanken. Da die Mikrotubuli vorn angetrieben wird, schwankt das Ende, bis die Bindung an eine neue Kinesin-Molekül weiter entlang der Glasträger friert in einem bestimmten Fluktuation. Weil Kinesin misst Mikrotubuli sehr stark, wird der Mikrotubulus gezwungen, den Weg des vorderen Endes folgen. Daher sind die statistischen Schwankungen in den Mikrotubuli Trajektorie eingefroren dieselben wie die statistischen Schwankungen des freien Endes der Mikrotubuli 11, und können daher verwendet werden, um die Persistenzlänge nach Anspruch 20 zu berechnen <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; wobei l p die Persistenzlänge des Mikrotubuli ist, θ ist der Winkel zwischen Tangenten an die Bahn durch eine Konturlänge s getrennt sind, und &lt;&gt; bedeutet einen Durchschnitt über alle Paare von Positionen durch eine Konturlänge s getrennt. Das Gleiten Assay selbst verwendet Kinesin biotinyliert am Coiled-Coil 21 spezifisch an den Glasobjektträger über eine Streptavidin-Biotin-Verknüpfung gebunden ist. Diese Befestigung gewährleistet, dass die Motor-Domänen frei, zu binden und zu treiben Mikrotubuli sind. Um Mikrotubuli Trajektorien folgen, werden Mikrotubuli spärlich mit organischen Farbstoffen 22,23 beschriftet - die Etiketten müssen spärlich genug, dass einzelne Fluorophore auflösbar sind mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie. Einzelne Fluorophore verfolgt werden mittels Bildanalyse-Routinen in IDL geschrieben. Die Trajektorien der einzelnen Fluorophor zu einem bestimmten mic gebundenrotubule werden in ein zusammengesetztes Mikrotubulus Trajektorie automatisch 24 kombiniert. Die Tangentenwinkel θ zu jedem Punkt entlang einer Trajektorie berechnet werden; dieser Tangentenwinkel die &lt;cos s&gt; Wert wird für jede Kontur Länge s berechnet. Schließlich werden diese Daten an Gl passen. Ein um eine Persistenzlänge bei gegebener Mikrotubuli zu extrahieren, oder für viele Mikrotubuli in der gleichen Gleiteigenschaften Assay. Das Verfahren ist robust genug, um mit Mikrotubuli in einer großen Vielzahl von Bedingungen (mit verschiedenen Stabilisierungsmitteln oder andere kleine Moleküle, verbunden mit den Mikrotubuli, mit gebundenen Mikrotubulus-assoziierte Proteine ​​(MAPs), oder mit einer Vielzahl von viskosen Lösungen) hergestellt arbeiten. Im Test wurde die Technik verwendet worden, um die Persistenzlänge Mikrotubuli als Funktion der Länge entlang der Mikrotubuli und Mikrotubuli mit verschiedenen Stabilisierungsmitteln charakterisieren. Die wichtigste Einschränkung ist, dass die Mikrotubuli muss noch support Kinesin Motilität. Da Kinesin ist ein robuster Motor Enzym, ist dies eine ziemlich lockere Einschränkung. Mikrotubuli durch Ersetzen mit Aktin und Myosin-Kinesin mit einer Familie Enzym kann die Persistenzlänge Actin unter Verwendung der gleichen Technik werden.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagenzien</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kaliumchlorid</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnesiumchlorid</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinylierten BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-Casein</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidin</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dithiothreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratories</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose-Oxidase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Katalase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-Mercaptoethanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Kaufen kleinen Betrag.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm Nr. 1 1/2 Deckglas</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm Nr. 1 Deckglas</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hochvakuumfett</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Ausrüstung</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF-Mikroskop</td&gt;<td&gt; Viele</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Die TIRF-Mikroskop in diesem Verfahren eingesetzt war hausgemacht.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (Software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Könnte ersetzen MATLAB, ImageJ oder andere Software zur Bildanalyse.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

Mikrotubuli sind Zytoskelett Polymere, die eine Rolle bei der Zellteilung, Mechanik und intrazellulären Transport. Jede dieser Funktionen erfordert Mikrotubuli, die steif und gerade genug, um eine signifikante Fraktion des Zelldurchmessers überspannen sind. Als Ergebnis hat die Persistenzlänge Mikrotubuli, ein Maß der Steifigkeit, aktiv in den vergangenen zwei Jahrzehnten 1 untersucht. Dennoch bleiben Fragen offen: kurze Mikrotubuli sind 10-50 mal weniger steif als lange Mikrotubuli 2-4, und noch lange Mikrotubuli Persistenz Längen, die von einer Größenordnung 5-9 unterschiedlich gemessen. Hier präsentieren wir eine Methode, um Mikrotubuli Persistenz Länge zu messen. Das Verfahren basiert auf einem Kinesin angetriebenen Gleitflug Mikrotubulus Assay 10 basiert. Durch die Kombination von spärlichen Fluoreszenzmarkierung einzelner Mikrotubuli mit single particle tracking einzelner Fluorophore an der Mikrotubuli, die gliding Trajektorien einzelner Mikrotubuli sind mit Nanometer-Ebene Präzision verfolgt. Die Persistenzlänge der Trajektorien ist die gleiche wie die Persistenzlänge des Mikrotubulus unter den verwendeten Bedingungen 11. Ein automatisiertes Tracking Routine wird verwendet, um Mikrotubuli Trajektorien aus Fluorophoren an einzelnen Mikrotubuli zu erstellen, und die Persistenzlänge dieser Trajektorie wird anhand Routinen in IDL geschrieben. Diese Technik ist rasch umsetzbar, und eine Messung des Persistenzlänge von 100 Mikrotubuli in einem Tag des Experimentierens. Das Verfahren kann erweitert werden, um Persistenzlänge unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich Persistenzlänge als Funktion der Länge entlang von Mikrotubuli zu messen. Darüber hinaus können die Auswerteroutinen zur Myosin-basierten Assays wirkenden Gleiten verlängert werden, um die Persistenzlänge Aktinfilamente sowie messen.

Ein Schnappschuss von einem Gleiten Test wird in Abbildung 2 dargestellt. Eine gute Mikrotubulus Dichte beträgt 1-10 Mikrotubuli je Sichtfeld; wesentlich in Falschabtastungen führen, wie Mikrotubuli einander kreuzen. Ein Plot der 11 Mikrotubulus Trajektorien aus den Segelflugplatz Assay in 2 ist in 3 gezeigt. Typische Trajektorien sind 10 bis 30 &amp;mgr; m lang, einige Bahnen haben Lücken, wo ein Mikrotubuli überquert anderen. Diese Trajektorien kann von der Analys...

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Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Aufrufe.  Lawrence University. Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Serie: Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Molekulare Verschränkung und Electrospinnability von Biopolymeren

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Methoden zur Selbst Integration von Megamolecular Biopolymere auf der Trocknungsluft-LC-Schnittstelle

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Eingabe Leistungsmessungen in gerührten Bioreaktoren im Labormaßstab

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Ein Millimeter Skala Biege-Prüfsystem zur Messung der mechanischen Eigenschaften von marinen Schwamm Knochensplitter

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.