Die Kalluskultur bietet eine Lösung für die genaue, effiziente und schnelle Bewertung des metabolischen Abbaus von Xenobiotika in Pflanzen. Die Kalluskultur kann Mikrobiom- oder Pilzstörungen und photochemischen Abbau ausschließen, den Matrixeffekt intakter Pflanzen vereinfachen, die Kultivierungsbedingungen standardisieren, die Behandlungsdauer verkürzen und weniger experimentellen Aufwand erfordern. Die hier vorgeschlagene Methode könnte Einblicke in das Aufnahmeverhalten und die Stoffwechselmechanismen verschiedener organischer Schadstoffe auf Nutzpflanzen geben und für die Bemühungen um Umweltrisikobewertungen nützlich sein.
Autoklavieren Sie zunächst alle Geräte und führen Sie alle Vorgänge auf einer UV-sterilisierten, ultrareinen Werkbank durch. Sterilisieren Sie die vernalisierte Samenoberfläche 20 Minuten lang mit 75%igem Ethanol. Spülen Sie sie dreimal mit sterilem deionisiertem Wasser ab und sterilisieren Sie sie erneut 20 Minuten lang mit 20%igem Wasserstoffperoxid.
Nachdem Sie die Samen sechsmal mit sterilisiertem deionisiertem Wasser gewaschen haben, keimen Sie aseptisch durch Aussaat auf autoklaviertem, hormonfreiem Murashige- und Skoog-Medium mit pH 5,8 und 1%igem Agargel und inkubieren Sie sie bei 26 Grad Celsius mit 16 Stunden Photoperiode für 15 Tage. Schneiden Sie nach 15 Tagen Sameninkubation das Hypokotyl und das Keimblatt des Sämlings in kleine Stücke von 0,5 Zentimetern, um die Explantate zu erhalten. Die Explantate werden in einer Petrischale mit 15 bis 20 Millilitern autoklaviertem Murashige- und Skoog-Medium, ergänzt mit Oxymon und Phycocyanin, umgewandelt und drei bis vier Wochen lang im Dunkeln bei 26 Grad Celsius inkubiert, um die Hornhaut zu induzieren.
Trennen Sie mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette die Hornhaut mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter, die sich aus den ursprünglichen Explantaten gebildet hat. Zur Behandlung 2,4-Dibromphenol in 10 Milliliter aseptischer Flüssigkeit Murashige und Skoog-Medium auflösen. Geben Sie dann drei Gramm abgetrennten Karotten-Kallus zu der vorbereiteten 2,4-Dibromphenol-Lösung.
Nachdem Sie das Medium wie im Manuskript beschrieben in Leerkontrolle vorbereitet haben, inkubieren Sie alle Kolben im Dunkeln. Um die Probe vorzubereiten, wird die Hornhaut vorsichtig von der 2,3-Dibromphenol-Behandlung und den Kontrollkolben durch Filtration mit 0,45-Mikron-Glasfaserfiltern getrennt. Waschen Sie die Hornhaut dreimal mit Reinstwasser, bevor Sie sie auffangen.
Trocknen Sie alle gesammelten Hornhaut und homogenisieren Sie 0,2 Gramm getrocknete Hornhaut mit einem Hochdurchsatz-Gewebeschleifer bei 70 Hertz für drei Minuten. Verwenden Sie eine Glasmikrospritze, um 50 Mikroliter ersatzdeuteriertes 4-n-Nanophenol für eine Minute in den homogenisierten Kallus und Wirbel zu geben. Geben Sie fünf Milliliter der Lösung, die ein gleiches Verhältnis von Methanol und Wasser enthält, zu dem stacheligen Kallus und beschallen Sie sie 30 Minuten lang, um das 2,4-Dibromphenol und die Metaboliten zu extrahieren.
Nach der Extraktion zentrifugiert man die Suspension 10 Minuten lang bei 8.000 g bei vier Grad Celsius und sammelt den Überstand durch Pipettieren. Führen Sie den Extrakt durch eine hydrophile lipophile balancierte Festphasenextraktion oder HLB-SPE-Kartusche mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Verdünnen Sie die Analyten, indem Sie sechs Milliliter Methanol durch die HLB-SPE-Kartusche leiten.
Anschließend wird der erhaltene Eluent unter einem sanften Stickstoffgasstrom für die instrumentelle Analyse auf einen Milliliter konzentriert. Öffnen Sie zur Analyse die Tür der Säulenheizung. Installieren Sie dann die Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiesäule, indem Sie den Säuleneinlass mit dem Injektionsventil und den Auslass mit dem Einlass des Massenspektrometers verbinden.
Führen Sie das Ende der Lösungsmittelröhrchen A und B in die entsprechenden Lösungsmittelflaschen ein. Platzieren Sie die Probenfläschchen nach Seriennummer an den entsprechenden Stellen der Probenschalen und setzen Sie die Probenschalen wieder in die Probenkammer ein. Klicken Sie im Softwarefenster auf Instrument und dann auf Einlassmethode, um die Bedingungen für das Flüssigkeitschromatogramm zu bearbeiten.
Wählen Sie MS-Methode und stellen Sie die Parameter der Massenspektrenanalyse ein. Klicken Sie auf Datei und dann auf Neu, um die Datenbank zu erstellen und zu benennen. Laden Sie das oben erstellte Beispielprogramm, indem Sie MS-Datei auswählen, gefolgt von Inlet-Datei und Inject-Volume.
Speichern Sie die Datenbank im Beispielordner des Projekts, indem Sie auf Datei und Speichern klicken. Wählen Sie als Nächstes Ausführen und Starten im Hauptfenster der Software und klicken Sie auf Beispieldaten erfassen, gefolgt von der Schaltfläche OK in der Startbeispielliste zum Sammeln von Daten. Um die Daten zu verarbeiten, wählen Sie die Zieldatenzeile aus und klicken Sie auf das Chromatogramm-Fenster, um das MS-Scan-Chromatogramm anzuzeigen.
Klicken Sie im Chromatogramm-Fenster auf Anzeige und dann auf TIC. Nachdem Sie auf die Scanwelle DS geklickt haben, fügen Sie trace und OK hinzu, um den Tochter-Massenspektren-Scan zu erhalten. Das Chromatogramm von 2,4-Dibromphenol-behandeltem Karottenkallusextrakt zeigte das Vorhandensein von acht verschiedenen Metaboliten im Vergleich zu den Kontrollproben.
Darüber hinaus deutet das Fehlen des Eltern-2,4-Dibromphenol-Peaks im Chromatogramm auf den schnellen Metabolismus von 2,4-Dibromphenol in der Karottenkallus unter experimentellen Bedingungen hin. Darüber hinaus führte 2,4-Dibromphenol, inkubiert in Karottenkallus, zur Bildung von Metaboliten durch direkte Konjugation mit Glukose und Aminosäuren. Alle Geräte sowie das Murashige- und Skoog-Medium sollten autoklaviert werden, um sicherzustellen, dass die Differenzierung und Pflege der Pflanzenkallus unter aseptischen Bedingungen durchgeführt wird.
Omics-Ansätze, die diesem Verfahren folgen, erlauben es, ein klares phytotoxisches mechanistisches Bild von Umweltschadstoffen zu erstellen.
