Übermäßiges Eisen führt zu freiem Redox-aktivem Eisen-Zwei-plus, das verheerende Auswirkungen innerhalb der Zelle verursachen kann, wie oxidativen Stress und Zellsterben durch Lipidperoxidation, die als Ferroptose bekannt ist. Quantitative Messungen von Eisen- und Eiseneisen sind der Schlüssel für einen genaueren Einblick in diese schädlichen Prozesse. Diese CE-ICP-Ms-Technik bietet sowohl eine schnelle Analyse als auch niedrige Quantifizierungsgrenzwerte, die beide für die Quantifizierung von Eisen-Redox-Arten erforderlich sind.
Wählen Sie zunächst einen Vernebler mit einem geringen selbstansaugenden Volumen aus und bereiten Sie die entsprechenden Teile vor, um die hausgemachte Schnittstelle zu montieren. Schließen Sie zwei dreiseitige Buchsen mit einem männlichen Kegel-Luer-Stecker an, indem Sie das linke Ende der unteren Drei-Wege-Luerstange mit dem Stecker und dem Stecker stecker an die mittlere Verbindung des oberen Drei-Wege-Luers anschließen. Als nächstes legen Sie ein ein Zentimeter langes Rohr über den Platindraht und verwenden Sie ein ein Zentimeter Silikonrohr, um das erste Rohr und die Düse eines männlichen Luer-Steckers zu verbinden.
Befestigen Sie die Baugruppe an der mittleren Verbindung des unteren Drei-Wege-Luer-Steckers durch Schraubendrehung. Schieben Sie ein ein Zentimeter langes Rohr über den Auslass der CE-Kapillare und positionieren Sie es acht bis neun Zentimeter vom Ende entfernt, und verbinden Sie es dann mit einem Silikonrohr an die Düse des männlichen Luer-Steckers. Legen Sie die gesamte Baugruppe durch die Stange des oberen Drei-Wege-T-Steckers und fixieren Sie den männlichen Luer-Stecker und das linke Ende des weiblichen Drei-Wege-Luer-Steckers durch Schraubendrehung.
Dann fixieren Sie das 25 Zentimeter große Silikonrohr an der Düse eines männlichen Luer-Steckers und fixieren Sie die gesamte Baugruppe an der Unterseite der Stange vom unteren Drei-Wege-Köderverbinder. Schieben Sie das ein Zentimeter lange Silikonrohr fest, fünf Millimeter über das Ende des Verneblers. Während der zweite männliche Luer-Kegel-Anschluss in den hervorstehenden Teil des Rohres gesteckt wird.
Bewegen Sie den Interface-Teil mit der hervorstehenden CE-Kapillare zum männlichen Kegel am Vernebler, dann legen Sie die Kapillare vorsichtig durch den männlichen Kegel und den breiteren Teil der Verneblerkapillare ein. Stellen Sie bei Bedarf die Länge der hervorstehenden Kapillare ein, indem Sie den linken männlichen Luer abschrauben, den Luer mit angeschlossenen Rohren in die gewünschte Position bewegen und neu installieren. Die oberen weiblichen Drei-Wege-Luer-Anschlüsse sollten eng am männlichen Kegel passen.
Wenn Sie mit dem Setup fertig sind, fahren Sie mit ICP-Ms fort. Kalibrierkurven wurden für Eisen drei und Eisen zwei Redox-Arten erstellt. Die Nachweisgrenzen lagen bei 3,1 Mikrogramm pro Liter für Eisen zwei und 3,2 Mikrogramm pro Liter für Eisen drei und die Linearität wurde bis zu 150 Mikrogramm pro Liter nachgewiesen.
Die Analyse des SH-SY5Y-Zelllysats zeigte aufgrund der etwas höheren Leitfähigkeit eine etwas langsamere Migration bei Eisenredoxarten. Die gemessenen Konzentrationen von Eisen drei und Eisen zwei betrugen 330 Mikrogramm pro Liter bzw. 84 Mikrogramm pro Liter. Das Ergebnis ergibt ein Eisen-Verhältnis von 2 zu 3 von 0,25.
Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist das sorgfältige Einsetzen der hervorstehenden CE-Kapillare durch die montierte Schnittstelle und deren geeignete Positionierung im Zusammenhang mit der Verneblerkapillare. Die hier vorgestellten Methoden können zu einem vielversprechenden Werkzeug werden, um den Einblick in eisenabhängige molekulare Prozesse zu vertiefen. Sorgfältig ausgearbeitete Studien sind erforderlich, um zu validieren, ob Eisen zwei-plus, Eisen Drei-plus-Quantifizierung kann als potenzieller Biomarker dienen, um Gewebe zu lokalisieren, das Risiko für eisenvermittelte tödliche Schäden im Zusammenhang mit neurodegenerativen und Krebserkrankungen.
