Hier haben wir ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Gehalts in tierischen Geweben bereitgestellt. Mit einem einfachen, gut etablierten kolorimetrischen Assay, der in den meisten Labors leicht implementiert werden kann. Der Bathophenanthrolin-basierte kolorimetrische Assay erfordert keine ausgefeilten Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung und kann für einen höheren Probendurchsatz und eine höhere Kosteneffizienz an das Mikrotiterplattenformat angepasst werden.
Dieses Protokoll eignet sich zum Nachweis von Veränderungen des Eisengehalts im Gewebe in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladungen oder Eiseneffizienz. Beginnen Sie mit dem Schneiden einer Gewebeprobe mit einem Gewicht von 10 bis 100 Gramm mit einer Skalpellklinge. Wiegen Sie es genau in einer Analysenwaage über ein kleines Stück Parafilm.
Verwenden Sie eine Kunststoffpinzette, um das Stück Gewebe in eine 24-Well-Platte zu legen. Lassen Sie es auf einem Standard-Inkubator bei 65 Grad Celsius für 48 Stunden trocknen. Alternativ können Sie das Stück Gewebe mit einer Stockpinzette in einen eisenfreien Teflonbecher geben und im Mikrowellen-Fermentationsofen des Labors trocknen.
Legen Sie jedes getrocknete Stück Gewebe über ein kleines Stück Paraform in einer Analysenwaage und wiegen Sie es genau. Geben Sie jedes getrocknete Stück Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie einen Liter der Säuremischung in das Röhrchen hinzu und schließen Sie es.
Bereiten Sie einen sauren Rohling auf die gleiche Weise vor, außer dass das Gewebe hier weggelassen wird. Inkubieren Sie die Röhren bei 65 Grad Celsius für 20 Stunden, um das Gewebe zu verdauen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur gelangen mit einer mit Kunststoffspitzen versehenen Mikropipette 500 Mikroliter des klaren Säureextrakts in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen.
Bereiten Sie Chromogenreaktionen direkt in die flachen 96-Well-, klaren, unbehandelten Polystyrol-Mikroplatten vor. Inkubierte Raumtemperatur für 15 Minuten. Messen Sie die Probenabsorption in einem Plattenleser bei einer Wellenlänge von 535 Nanometern gegen eine deionisierte Wasserreferenz.
Die Bestimmung von Nicht-Häm-Eisen durch die Küvette und 96-Well-Mikrotiterplatten-basierte kolorimetrische Assays sind hier dargestellt. Die Korrelation zwischen küvettenbasierten und Mikroplatten-basierten Nicht-Häm-Eisenspiegeln in 55 Gewebeproben von sechs Monate alten männlichen Schwarzen, sechs Mäusen, einschließlich Leber, Milz, Herz, Lunge und Knochenmark, ist hier gezeigt. Die hohe Korrelation zwischen den beiden Methoden deutet darauf hin, dass die Mikroplatten-basierte Methode eine gültige Alternative zur ursprünglichen Küvetten-basierten Methode ist.
Schließlich wurden die Nicht-Häm-Eisengehalte mit der auf Mikroplatten basierenden Methode quantifiziert, nachdem saure Proben aus denselben Geweben entweder mit einer Mischung aus Salzsäure und Trichloressigsäure oder Salzsäure allein verdaut wurden. Die hohe Korrelation zeigt, dass Trichloressigsäure aus dem Säureaufschluss abgegeben werden kann. Das repräsentative Bild zeigt die Nicht-Häm-Eisenspiegel in Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse von männlichen schwarzen sechs Wildtypmäusen und männlichen Hepcidin-Knockout-Mäusen auf schwarzem Sechs-genetischem Hintergrund, gemessen mit Bathophenanthrolin-basiertem kolorimetrischem Assay.
Die Störung von Hepcidin führt zu einer Hämochromatose wie Eisenabscheidung Phänotyp mit schwerer hepatischer, pankreatischer und kardialer Eisenakkumulation und Milzeisenmangel. Hepatische Nicht-Häm-Eisenwerte in juvenilen weiblichen europäischen Wolfsbarschen nach experimenteller Eisenmodulation sind hier dargestellt. Der Eisengehalt der Leber stieg bei eisenbehandelten Tieren massiv an.
Während Anämie eine leichte Verringerung der Lebereisenspeicher verursachte. Die repräsentativen Bilder zeigen die Nicht-Häm-Eisenspiegel bei einem Monat alten Drosophila, gemessen mit einem Bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay. Die Ergebnisse zeigen den Nicht-Häm-Eisengehalt in jedem Pool von 20 Fliegen oder den geschätzten Eisengehalt jeder Fliege.
Betrachtet man ein Durchschnittsgewicht von 0,64 Milligramm pro Fliege. Denken Sie bei diesem Vorgang daran, den gesamten Glasverschleiß gründlich zu reinigen und die metallischen Labormaterialien aufgrund des Risikos einer Kontamination nicht mit einem Reagenz oder einer Lösung in Berührung kommen zu lassen.
