Zebrafische sind ein attraktives Modell, aber Wissenschaftler wissen nicht, wie viel der Organismus mit Wasserdosierung aufnimmt. Wir haben eine Technik entwickelt, um Gewebe nach der Exposition zu verdauen und Metalle über ICPMS zu quantifizieren. Diese Technik ermöglicht es uns, die Dosis-Wirkungs-Beziehung mit ICPMS genau zu quantifizieren und zu validieren.
Diese Methode hat viel Potenzial. Pharmakologische oder umweltbedingte Metallexpositionen können von der zellulären Ebene bis hin zu ganzen Organsystemen in Tiermodellen angewendet werden. Fügen Sie den 15-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für bis zu 10 Larven etwa 0,25 Milliliter hochreine Salpetersäure hinzu.
Ultraschall für eine Stunde, um die Proben vorzuverdauen. Führen Sie für Ultraschall kurze Zyklen der Gewebeverdauung mit Fünf-Minuten-Intervallen in einem säuresicheren Mikrowellenfermenter durch, bis das gesamte Gewebe sichtbar oxidiert ist und eine gleichmäßige, klare gelbe Lösung entsteht. Überwachen Sie die Integrität der Röhrchen sorgfältig, um einen Bruch zu vermeiden, und führen Sie kurze Drehungen in der Zentrifuge zwischen den Zyklen durch.
Sobald das Gewebe sichtbar oxidiert ist, verdünnen Sie die Proben in einem Abzug auf 3,5% Salpetersäure mit 6,75 Millilitern hochreinem Wasser und Vortex, um gründlich zu mischen. Führen Sie dann eine matrixangepasste 7-Punkt-Kalibrierkurve durch, um mögliche isobare Interferenzen zu berücksichtigen. Nehmen Sie unter Verwendung einer Stammkonzentration des wässrig zertifizierten Elementarstandards ein 0,1-Milliliter-Aliquot und pipettieren Sie es in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Mit 3,5% Salpetersäure auf ein Endvolumen von 10 Millilitern verdünnen, um 10 Teile pro Milliarde Standardlösungen herzustellen. Verwenden Sie die 10 Teile pro Milliarde Lagerbestand, machen Sie die seriellen Verdünnungen 0,1, 1,0 und 5,0 Teile pro Milliarde Standardlösungen in 3,5% Salpetersäure. Verwenden Sie den 0,1-Stamm, machen Sie die seriellen Verdünnungen 0,001, 0,005 und 0,01 Teile pro Milliarde Standardlösungen in 3,5% Salpetersäure.
Bevor Sie das ICPMS-Instrument für die Probenanalyse vorbereiten, stellen Sie sicher, dass das Argongasventil geöffnet ist, alle Schläuche sicher verbunden und sauber sind, 5% Salpetersäure zum Spülen von Schläuchen und Glaswaren zwischen den Probenanalysen geöffnet ist. Überprüfen Sie den Zustand der Taschenlampe und der Zapfen und stellen Sie sicher, dass der Brennerkasten sicher verriegelt ist. Und das Sprühkammer-Entwässerungsrohr ist korrekt mit der Peripumpe verbunden.
Öffnen Sie die Software, überprüfen Sie die Vakuummesswerte und stellen Sie sicher, dass alle Turbopumpen mit 100% laufen.Klicken Sie im Statusfenster des Plasmasteuerungssystems auf START, um die Startsequenz zu starten. Schalten Sie die Plasmapumpe und den Plasmakühler ein, setzen Sie den Vernebler und zünden Sie das Plasma an. Warten Sie, bis das Plasma leuchtet und stabil ist, wenn das Statusfenster anzeigt, dass die Startsequenz abgeschlossen ist.
Beachten Sie an dieser Stelle die grünen Punkte im Systemstatusfenster, die anzeigen, dass alle Netzteile eingeschaltet sind. Klicken Sie in der Menüleiste im Dropdown-Menü auf Steuerung, Autosampler. Geben Sie die Autosampler-Rack-Position für das Röhrchen mit 5% Salpetersäure ein, lassen Sie die Säure in das Plasma gelangen.
Klicken Sie in der Menüleiste im Dropdown-Menü auf Scans, Magnet. Geben Sie im MagnetScan-Fenster 115 in die Position der Markermasse ein und drücken Sie die Eingabetaste. Lassen Sie den Magneten 30 Minuten lang über den Massenbereich scannen, während sich das Instrument erwärmt.
Verwenden Sie nach 30 Minuten die Autosampler-Steuerung, um in die Position einer Multielement-Tuninglösung mit einem Teil pro Milliarde zu wechseln. Saugen Sie die Stimmlösung ab und stimmen Sie das Instrument ab, um die Signalablesung zu optimieren. Stellen Sie die Brennerposition für die Koordinaten X, Y, Z so ein, dass die Brenner mit der Mitte der Kegel und der Durchflussrate des Verneblers im Fenster Plasmasteuerung ausgerichtet ist.
Nehmen Sie die erforderlichen Anpassungen im Abstimmungsfenster der Ionenoptik für die Quelle, den Detektor und den Analysator vor. Sobald die Signallesung optimiert ist, klicken Sie im Fenster Magnet Scan auf Stopp, klicken Sie auf Magnet kalibrieren und wählen Sie im Popup-Fenster eine niedrige Auflösung aus. Klicken Sie auf OK und öffnen Sie die SMC-Datei der Massenkalibrierung, um den Magneten zu kalibrieren.
Klicken Sie auf Speichern, Verwenden, um die aktuelle Magnetkalibrierung auf die Analysen anzuwenden. Wenn Sie unbekannte Proben mit einem großen Konzentrationsbereich messen, führen Sie eine Detektorkalibrierung durch, um Ionenpulszahlsignale bei niedrigen Konzentrationen mit abgeschwächten Ionensignalen zu vergleichen, die bei höheren Konzentrationen erzeugt werden. Starten Sie die Beispielanalyse, indem Sie auf Datenerfassung und dann im Dropdown-Menü auf Methodeneinrichtung klicken.
Verwenden Sie eine vorhandene Methode, die vom Hersteller bereitgestellt wird, oder erstellen Sie eine Methode basierend auf den Elementen von Interesse. Passen Sie bei Bedarf den Analysemodus, die Verweildauer, die Schaltverzögerung, die Anzahl der Sweeps und Zyklen, die Auflösung, den Erfassungsmodus und die Parkmasse für die Deflektoreinstellungen an. Klicken Sie auf Speichern, um die Methodeneinstellungen aufzuzeichnen.
Optimieren Sie die Parameter für jedes Metall und jeden Isotyp. Klicken Sie in der Menüleiste auf Datenerfassung. Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Batch Run.
Alternativ können Sie auf das BATCH-Symbol unter der Menüleiste klicken, die Batch-Parameter aus einer Tabelle importieren oder eine Sequenz im Fenster Batch Run erstellen. Geben Sie den Beispieltyp, die Position des Autosampler-Racks, die Übertragungszeit, die Waschzeit, die Replikate, die Proben-ID und die Methodendatei ein. Ordnen Sie den Chargenlauf für Standardlösungen für die Kalibrierkurve an, gefolgt von einem Qualitätskontrollstandard und dann unbekannten Proben.
Überwachen Sie die Gerätedrift und die Reproduzierbarkeit der Proben, indem Sie alle 5 bis 10 Proben einen Qualitätskontrollstandard von 0,5 Teilen pro Milliarde angeben. Gewebeaufnahmestudien wurden mit wässrigen Expositionen von Cisplatin und einer neuartigen Ruthenium-basierten Anti-Krebs-Verbindung PMC79 durchgeführt. Letalität und verzögertes Schlüpfen wurden auf nominale Konzentrationen von Cisplatin untersucht.
0, 3,75, 7,5 15, 30 und 60 Milligramm pro Liter Cisplatin. Die Platinakkumulation im Gewebe des Organismus wurde durch ICPMS-Analyse bestimmt, und das Gewebe des Organismus enthielt entsprechende Dosen von 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 und 461,9 Nanogramm pro Organismus. Ein verzögertes Schlüpfen wurde bei allen Cisplatinkonzentrationen beobachtet.
Nach der Dechorionation wurden Chorionen gesammelt und separat auf Platin analysiert. Nichtletale Dosen von Cisplatin, die für Dechorionationsstudien verwendet wurden, bestimmten, dass sich 93 bis 96% der gesamten abgegebenen Dosis von Cisplatin im Chorion angesammelt hatten, während die verbleibende Dosis im Larvengewebe angefallen war. Zebrafischlarven wurden bei 0, 3,1, 6,2, 9,2 und 12,4 Milligramm pro Liter PMC79 exponiert.
Diese Konzentrationen wurden analytisch so bestimmt, dass sie 0, 0,17, 0,44, 0,66 und 0,76 Milligramm pro Liter Ruthenium enthalten. Im Gegensatz zu diesem Cisplatin wurde bei den PMC79-exponierten Larven kein verzögertes Schlüpfen beobachtet. Chorionen wurden nicht in die Rutheniumanalyse einbezogen, da sie vor der Larvensammlung auf natürliche Weise abgebaut wurden.
Das massive Metall im Larvengewebe, das bei jeder Konzentration analysiert wurde, betrug 0,19, 0,41 und 0,68 Nanogramm Ruthenium pro Larve. Jedes der dem Expositionsprotokoll zugesetzten Reagenzien bietet das Potenzial für isobare Interferenzen. Wenn möglich, sollten Sie Alternativen wie schnelle Abkühlung im Vergleich zu Tricain in Betracht ziehen.
Diese Methode ermöglicht es, die Quantifizierung der Metalldosis auf Toxizität, Wirksamkeit und Experimente mit höheren Wirbeltieren zu vergleichen. Wir waren besonders aufgeregt, dass unsere Schwellendosis innerhalb einer Größenordnung lag, die den Patienten verabreicht wurde.
