Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_135278) SST unterstützt. MOP ist der Begünstigte einer Promotionsstipendium der AXA Forschungsfonds. Wir bedanken uns bei Patricia Nigg für die Hilfe bei der Gestaltung der Figur 1.

Beachten Sie vor dem Start: Verwenden Sie Laminarströmungshaube und geeignete biocontainment bei der Arbeit mit Lebendvirus. Hier beschreiben wir das Wachstum geeigneten Bedingungen, um Kulturinfluenzavirusstamm A / WSN / 33. Multiplizität der Infektion (MOI) und Inkubationszeiten können je nach Virusstamm variieren. 1. Herstellung von biotinyliertem A / WSN / 33-Virus <ol><li> Samen Madin-Darby canine kindey Zellen (MDCK) in eine T175 cm 2 -Kolben mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen / Strep) ergänzt. Kulturzellen bei 37 ° C bis ungefähr 70% Konfluenz erreicht wird. </li><li> Vor der Infektion zu entfernen Medium und wäscht die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH7.0-7.3) durch Zugabe einer ausreichend großen Volumen, um die Zellschicht zu bedecken. </li><li> Entfernen PBS und infizieren Zellen mit A / WSN / 33 mit einer MOI von 10 -4. Verdünnte Virus in PBS, ergänzt mit 0,02 mg Mg 2+, 0,01 mg Ca 2+ &lt;/ sup&gt;, 0,3% Rinderserumalbumin (BSA) und 1% Pen / Strep (Infektion-PBS). Verwenden Sie ein Inokulum von 4 ml für eine T175 cm 2-Kolben. </li><li> Inkubiere Zellen 1 h bei 37 ° C. Entfernen Inokulum durch Aspiration und Pipette 10 ml DMEM mit 0,3% BSA, 20 mM HEPES und 1% Pen / Strep in den Kolben ergänzt. </li><li> Zellen bei 37 ° C für etwa 3 Tage bis cytopathischen Effekt (CPE) zu sehen ist, und dann Ernte Standes. CPE als Aufrundung der Zellen, gefolgt von Ablösung und Tod von Zellen 14 erkannt werden. </li><li> Spinüberstand bei 450 · g für 5 min, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Überstand in ein neues Falcon-Röhrchen und ein weiteres Mal wiederholen Sie diesen Schritt. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Transfer-Überstände in Ultrazentrifugenröhrchen und Unterstände mit 5 ml 30% Saccharose in NTE-Puffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) verdünnt. Balancieren Rohre vor Ultrazentrifugation und füllen sich mit PBS, um ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen. Spin supernanern bei 112.398 xg (entsprechend 25.000 rpm für einen SW28 Rotor) für 90 min in einer Ultrazentrifuge. </li><li> Überstand vorsichtig abnehmen durch Pipettieren und genießen Viruspellet über Nacht bei 4 ° C in 250 ul PBS. Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Messen Proteingehalt des gereinigten Virus durch Bradford-Assay 15. </li><li> Verwenden Sie einen Biotinylierungskit an biotinylierte A / WSN / 33 zu erzeugen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Kurz gesagt, fügen Sie die entsprechende Menge an Biotin zu dem gereinigten Virus und Inkubation für 2 Stunden auf Eis. Übertragen Virus ein Ultrazentrifugenröhrchen und das Füllrohr mit PBS auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen. Spin Virus bei 112.389 × g für 90 min in einer Ultrazentrifuge. Überstand entfernen durch Pipettieren und fügen Sie 250 ul PBS. Soak Pellet über Nacht bei 4 ° C. Aliquot und speichert das biotinylierte Virus bei -80 ° C gelagert wird, wo sie für mindestens 24 Monate stabil. HINWEIS: Es könnte hilfreich sein, um den Titer des biotinylierten p bestimmen,Reparatur von IAV durch Standard-Plaque-Test. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die nachfolgenden Protokoll nur biotinylierte Viruspartikeln zu messen. Restlichen biotinylierten Partikel aufgrund unvollständiger Biotinylierung wird dem Infektionstiter mittels Plaque-Assay, aber nicht zu dem Signal in dem Befestigungs- / Internalisierung Assay gemessen bei. </li></ol> 2. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an biotinyliertem Virus Hinweis: Vor dem Anschließen / Internalisierung Assay durchgeführt wird, ist es wichtig, die Menge an biotinyliertem Virus benötigt, um alle Zellen einer Probe zu infizieren bestimmen. <ol><li> Kultur und trypsinize A549 Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zellenkammer. Pipette 200.000 A549-Zellen in FACS Deepwell Rohre. Spin 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet mit 200 ul PBS. Coole Zellen nach unten auf Eis für 10 min. </li><li> Bereiten Sie das 5-fache serielle Verdünnungen der biotinylated Virusstamm in infektions PBS. </li><li> Spin Röhrchen mit den Zellen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet mit 100 ul virushaltigen Infektion-PBS. Wie Mock Steuer Verwendung infektions PBS ohne biotinyliertes Virus. Röhrchen auf Eis für 1 Stunde inkubiert. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. </li><li> Zur Fixierung, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 100 ul 3,7% Paraformaldehyd (PFA). Inkubation für 10 min bei RT. Wiederholen Sie dann in 2.4 beschriebenen Waschschritt). </li><li> Zur Permeabilisierung, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 100 ul PBS, das 0,5% Triton X-100. Inkubation für 6 min bei RT. Wiederholen Sie dann in 2.4 beschriebenen Waschschritt). </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und resuspendieren pellet in 50 &amp; mgr; l 2% BSA in PBS, das STV-Cy3 verdünnt. (Bitte beachten Sie, sollte die entsprechende Konzentration des STV-Cy3 vor dem Start des Experiments bestimmt werden Beginnen Sie mit einer Konzentration von 1:. 200 und Test 2-fache Verdünnungen bis zu 1:. 2400 In unseren Händen, eine Verdünnung von 1: 1000 bewiesen optimal zu sein.) </li><li> Inkubieren 1 Stunde im Dunkeln bei RT. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben, aber das Pellet in 200 ul 2% BSA in PBS verdünnt. </li><li> Analyse Proben mittels Durchflusszytometrie 16. Tor auf der Cy3-positiven Population. Wählen, die niedrigste Konzentration an biotinyliertem Virus was zu der maximalen Anzahl von Cy3-positiven Zellen in der A549 Bevölkerung. </li></ol> 3. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Streptavidin HINWEIS: Die Effizienz der Blockierung der von extrazellulärem Virus abgeleitete Signal bestimmt den Erfassungsbereich des Assays. Daher ist es wichtig, den STV-Cy3-Signal so weit wie möglich aufheben. The erforderliche Menge an STV benötigt wird, hängt von der Menge an biotinyliertem Virusstamm verwendet (in Abschnitt 2 bestimmt). <ol><li> Führen Sie die Schritte 2,1 bis 2,4, aber verwenden Sie in Abschnitt 2 festVirusKonzentration. </li><li> Vorbereitung Fünffache Serienverdünnungen STV in PBS, enthaltend 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 &amp; mgr; STV Verdünnung. Wie Mock Steuer Verwendung PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid ohne STV. Röhrchen für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben. </li><li> Führen Sie die Schritte 2,5-2,9. Für die Internalisierung Assay, wählen Sie die niedrigste Konzentration des STV, was zu einem starken Block der Cy3-Signals (im Vergleich zu der Probe, in der kein STV war vorhanden). Hierzu kann der Prozentsatz von Cy3-positiven Zellen oder der mittleren Fluoreszenzintensität des Cy3-Signal verwendet werden. Idealerweise sollte das Cy3 Signal STV-behandelten Proben so nahe an dem Signal von mock-infiziertZellen wie möglich. </li></ol> 4. Befestigung / Internalisierung Assay HINWEIS: Sicherstellen, dass alle Reagenzien vor Testbeginn vorzubereiten. Für die drei Kontrollgruppen im Ergebnisteil (mock-infizierten Zellen, Neuraminidase vorbehandelt Zellen und Natriumazid Zellen) präsentiert kleine Änderungen an dem Protokoll erforderlich. <ol><li> Bereiten Sie 16 Deepwell Rohre jeweils 200.000 A549-Zellen enthält. Neben der experimentellen Set bestehend aus 4 Röhren gibt es 3 Kontrollbedingungen, die jeweils benötigt 4 Röhren: mock-infizierten Zellen, Neuraminidase (NA) -pretreated Zellen und Natriumazid behandelten Zellen. Jede Gruppe besteht aus 4 Röhren als &quot;0 min&quot;, &quot;0 min + STV &#39;, &#39;30 Minuten&#39;, &#39;30 min + STV &#39;beschriftet. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C bei 450 x g. Überstand entfernen und resuspendieren pellet in 200 ul DMEM, enthaltend 0,3% BSA, 20 mM HEPES und 1% Penicillin-Streptomycin (Inkubationsmedium). Inkubation für 30 min bei 37 ° C. HINWEIS: Für die Neuraminidase Steuerung: Verwenden Sie bakterielle Neuraminidase (zB Sialidase aus Vibrio cholera) in einer Konzentration von 200 mU / ml in Inkubationsmedium verdünnt, um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, dann kühlen Rohre nach unten auf Eis für 10 min. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand und Pellet in 100 ul biotinyliertes Virus zu entfernen (verwenden Sie die Viruskonzentration in Abschnitt 2 in infektions PBS bestimmt). Inkubieren Sie 1 Stunde auf Eis. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben. HINWEIS: Für den Mock-infizierten Kontroll: Verwendung Infektion-PBS ohne Virus. Für Natriumazids Control: Nutzung Virus in Infektions-PBS verdünnt, ergänzt mit 0,1% Natriumazid. </li><li> ProfiBearbeitung der Proben nach der Infektion auf Eis: <ol><li> Für die &quot;0 min&quot; Proben, folgen Sie Schritt 2,5 und Lagerung von Proben bei 4 ° C, bis die anderen Proben werden fixiert. </li><li> Für die &quot;0 min + STV&quot; Proben, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 &amp; mgr; STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 fest Konzentration) in PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt (zur Internalisierung zu verhindern, während der Handhabung der Probe). Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C. </li><li> Für die &#39;30 min &quot;Proben, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 ul PBS, das 2% BSA. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C. ANMERKUNG: Die Natriumazid Kontrolle: Mit PBS, ergänzt mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid für 30 min Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Für die &quot;30 min + STV Proben der Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 ul PBS, das 2% BSA. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Dann Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 &amp; mgr; STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 fest Konzentration) in PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt (zur Internalisierung zu verhindern, während der Handhabung der Probe). Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C. ANMERKUNG: Die Natriumazid Kontrolle: Mit PBS, ergänzt mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid für 30 min Inkubation bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Führen Sie die Schritte 2,6-2,8 und Proben zu analysieren mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Cy3-positiven Zellen in jeder Probe. </li><li> Der prozentuale Anteil befestigt Virus und die relative Menge der internalisierten Virus. <ol><li> Um die Menge der beigefügten Virus zu berechnen verwenden Sie den Prozentsatz der Cy3-positive geschlossene Zellen oder die mittlere Fluoreszenzintensität der Cy3-Signal. Zum Vergleich gesetzt unbehandelten Zellen auf 100% (4B). HINWEIS: Der Prozentsatz der beigefügten Virus wird durch die &quot;0 min&quot; Probe beschrieben. </li><li> Um die Menge der internalisierten Virus zu berechnen, nehmen Sie das Verhältnis der &quot;30 min + STV&quot; Probe auf die &quot;30 Minuten&quot; Probe (5B). HINWEIS: Wie oben erwähnt, kann der Prozentsatz von Cy3 positive gated Zellen oder der mittleren Fluoreszenzintensität des Cy3-Signal verwendet werden. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Unser Protokoll beschreibt eine einfache Möglichkeit zur Messung der Virus-Bindung und Internalisierung durch Durchflusszytometrie. Es erlaubt die Verwendung von markierten Wildtyp-Virus, das imitiert enger Virus-Infektionen im Vergleich zur Verwendung von virusähnlichen Partikeln (VLP). Während unsere Protokoll wurde optimiert, um Bindung und Internalisierung von IAV messen, kann es leicht für andere Viren angepasst werden. Darüber hinaus, wie Durchflusszytometrie ist zum Auslesen verwendet, aufeinander Färbungen...

Der Eintrag von Influenza-A-Virus (IAV) ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bindung des Virus an Rezeptoren auf der Plasmamembran von Zielzellen 1 beginnt. Der Rezeptor für die IAV Sialinsäure, die auf einer Vielzahl von Glykoproteinen und Glykolipiden vorliegt. Das Hämagglutinin (HA) Proteins der IAV, die in der Virushülle vorhanden ist bindet an Sialinsäure und vermittelt so die Befestigung der viralen Partikel in der Plasmamembran von Zielzellen 2. Das Virus tritt in die Zellen über Clathrin-vermittelte Endozytose, sondern auch alternative Eintrittswege wie Makropinozytose, beschrieben worden, 3-6. Die Wechselwirkung zwischen HA und Sialinsäure ausreichend erscheint zum Vermitteln sowohl Befestigung und Auslösen Internalisierung von Viruspartikeln 7 sein. Dennoch alternative Eingabe Rezeptoren wurden vorgeschlagen und ihre Rollen in IAV Eintrag werden derzeit untersucht 1,8,9. CurBeauty Preis werden Anstrengungen unternommen, um Wirtsfaktoren, die im viralen Lebenszyklus mit dem Ziel der Entwicklung von dringend benötigten neuen antiviralen Therapien 10-12 beteiligt sind, zu identifizieren. Virus Eintrag würde eine günstige Schritt für die Ausrichtung IAV Wachstum, um eine virale Infektion in seinen frühesten Zeitpunkt zu blockieren. Mess verschiedenen Stadien der IAV Eintrag experimentell ist anspruchsvoll wie in der Regel große Mengen des Virus erforderlich sind, um eingehende Virus zu erkennen. Zusätzlich kann der Erfassungsbereich für Änderungen in den Eintritt des Virus ist nur linear durch das Fehlen der viralen Replikation. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Tests mit hoher Empfindlichkeit. Der Test wir hier erlaubt den Nachweis gebunden Virus an der Zelloberfläche als auch internalisiert Nachweis von Viren in Bezug auf die Gesamtmenge der Zell-assoziierten Virus. Die Verwendung von biotinylierten Wildtyp-Virus ermöglicht die bequeme Messung durch Färbung mit STV-Cy3 und Auslesen mittels Durchflusszytometrie. Biotinylierte Virus ist kalt gebunden an Zells, um die Befestigung zu ermöglichen, sondern verhindern, Internalisierung von Viruspartikeln. Die Zellen können fixiert werden, permeabilisiert und mit STV-Cy3 gefärbt, um die angeschlossenen Virus zu messen. Das Signal von extrazellulären, befestigt Virionen können aufgehoben werden, wenn ein Blockierungsschritt vor der Fixierung in dem die Zellen mit nicht-markiertem Streptavidin (STV) inkubiert aufgetragen. In einem nächsten Schritt, nach Bindung von biotinyliertem IAV, Temperatur wird auf 37 ° C verschoben und Internalisierung von viralen Partikeln stattfinden darf. Internalisierten Partikel von Bindung von STV dadurch die Unterscheidung zwischen extra- und intrazellulärer Viren so geschützt. Pro Versuchsbedingung werden vier Proben erforderlich: &#39;0 min &quot;: Die erste Probe, bezeichnet mit&quot; 0 min &quot;zu kalt gebundenen Virus an der Zelloberfläche zu messen. &#39;0 min + STV&#39;: Die zweite Probe, &#39;0 min + STV&#39; markiert sind, gibt die Basissignalintensität des Experiments. Befestigt Virus blockiert with STV und das Signal nach Färbung mit STV-Cy3 sollte viel niedriger im Vergleich zu den &quot;0 min&quot; Probe sein. &#39;30 Min &quot;: Die dritte Probe, &#39;30 min &#39;enthält befestigt und internalisiert Virus infolge der Temperaturverschiebung auf 37 &amp; deg; C für 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: Die vierte Probe, &#39;30 min + STV &quot;Maßnahmen der intrazelluläre Anteil von Viren. STV Blockierungsschritt nach dem 30 min Inkubationszeit aufgetragen. Als Ergebnis werden Viruspartikel an der Zelloberfläche durch STV wobei nur internalisiert Viren zur Verfügung Färbung mit STV-Cy3 gebunden. Die relative Menge internalisiert Virus kann als das Verhältnis der internalisierten Virus (im &#39;30 min + STV &#39;gemessene Probe) dividiert durch die Gesamtvirusmenge (von der &#39;30 min beschriebenen &quot;Probe) berechnet werden. Als Kontrollen schlagen wir vor, mock-infizierten Zellen enthalten. Das Signal nach STV-Cy3-Färbung von mock-infizierten Zellen gibt den Hintergrunddie sich aus dem Färbungsprotokoll. Eine Steuerung für IAV Befestigung ist die Vorbehandlung von Zellen mit bakteriellen Neuraminidase (NA). NA abspaltet Sialinsäure von zellulären Glykoproteine, wodurch Befestigungs Rezeptoren von der Zelloberfläche zu entfernen. Natriumazid (SA) ist ein potenter Inhibitor metabolischen und dadurch blockiert Endozytose 13. Zellen mit Natriumazid sollte positiv für Virusbindung, aber negativ für die Internalisierung sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Ein Cartoon beschreiben die vier verschiedenen experimentellen Bedingungen ist in Figur 1 gezeigten Ergebnissen eines repräsentativen Experiments sind in den 2 vorgelegt. - 5. In der &quot;0 min&quot; Probe ist biotinyliertes Virus Kalt verpflichtet, Zellen, die durch STV-Cy3-Färbung sichtbar gemacht werden können, zielen (Abbildungen 1 und 2). Wenn ein Blockierungsschritt (in der &quot;0 min + STV&quot; Probe) angew...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Aufrufe.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Serie: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.