Wir danken Fabrice Agou und Alix Boucharlat von der Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) am Institut Pasteur Paris für hilfreiche Vorschläge zum Protokoll, allen Mitgliedern der BGPB-Einheit für Unterstützung und wissenschaftliche Diskussionen und Simon Legood für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wurde von Global Care Initiatives des Instituts Carnot Infektionskrankheiten und des Instituts Carnot Microbes and Health finanziert (15 CARN 0017-01 und 16 CARN 0023-01).

1. Enzym- und Substratzubereitung
<ol><li>Reinigung von Enzymen
	<ol><li>Herstellung und Reinigung des Lnt-Enzyms aus waschmittellöslichen Membranen, wie zuvor beschrieben 4,8. Kurz gesagt, induzieren Sie die Expression des lnt-Strep-Gens, das Lnt mit einem C-terminalen Streptokokken-Tag kodiert, bei OD 600 von 0,6 mit wasserfreiem Tetracyclin (200 ng / ml) bei 37 °C für 16 h.</li>
		<li>Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 10 min und verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet im Puffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) auf 100 OD600 Einheiten pro ml.</li>
		<li>Brechen Sie die Zellen durch zwei Durchgänge durch eine französische Druckzellenpresse bei 10.000 psi.</li>
		<li>Entfernen Sie ungebrochene Zellen und Ablagerungen durch Zentrifugieren bei 13.000 x g für 20 min. Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 120.000 x g für 60 min und sammeln Sie die Membranvesikel (durchscheinendes braun gefärbtes Pellet). Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Lösen Sie die integralen Membranproteine aus dem Membranpellet mit 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-Maltosid (DDM) im Puffer WA für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Zentrifugieren und entfernen Sie unlösliches Material bei 120.000 x g für 30 min. Verwenden Sie die überstehende Fraktion zur Reinigung.</li>
		<li>Lnt-Streptokokken auf einer Affinitätschromatographiesäule (siehe Materialtabelle) und einer S400-Gelfiltrationssäule (siehe Materialtabelle) reinigen, wie von Nozeret et al.8 beschrieben.</li>
		<li>Lagern Sie das gereinigte Enzym im Puffer WA mit 0,05% DDM und 10% Glycerin bei -80 °C. HINWEIS: Das Enzym ist über 5 Jahre stabil.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Alkin-Phospholipid- und biotinylierten Fibroblasten-stimulierenden Liganden (FSL-1-biotin) Substraten
	<ol><li>Aliquot 100 μL kundenspezifisch synthetisiertes Alkin-POPE (1-Hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, siehe Tabelle der Materialien), in Chloroform in 1,5 ml Röhrchen gelöst.</li>
		<li>Durchstechen Sie die Röhrchen mit einer Spritze und verdampfen Sie das Chloroform in einem Speed-Vac bei RT für 2 h. Lagern Sie die trockenen Phospholipidproben bei -20 °C.</li>
		<li>Alkin-POPE vor Gebrauch in 0,1% Triton X-100 bei 500 μM auflösen. Fügen Sie einen 3-minütigen Ultraschallschritt in einem Ultraschall-Wasserbad bei RT hinzu, um Alkin-POPE bei Bedarf zu lösen.</li>
		<li>FSL-1-Biotin in Wasser bei 445 μM resuspendieren. HINWEIS: Beide Lösungen können mindestens 2 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Röhrchen-Assay
HINWEIS: Stellen Sie an Tag 1 die Lnt-Reaktion in 1,5-ml-Röhrchen ein (Schritt 2.1) und beschichten Sie 96 Well-Platten mit Streptavidin (Schritt 2.2).
<ol><li>Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion
	<ol><li>Für einen Standard-Lnt-Assay mischen Sie Alkin-POPE (endgültige 50 μM aus 500 μM-Vorrat) und FSL-1-Biotin (Endkonzentration von 50 μM aus einem 445 μM-Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Endvolumen von 18 μL in 1,5-ml-Röhrchen. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch.</li>
		<li>Die Substratmischung (hergestellt in Schritt 2.1.1) wird 3 min lang in einem Ultraschall-Wasserbad beschallt und vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubiert (Schritt 2.1.3). HINWEIS: MTSES (Natrium(2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonat), ein thiolspezifisches Reagenz, hemmtLnt 8. 10 mM MTSES (100 mM Stammlösung in 100% DMSO) in die Reaktionsröhrchen geben (Schritt 2.1.1), die als Negativkontrollproben verwendet werden sollen. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Reaktionspuffers so ein, dass das Gesamtvolumen 18 μL beträgt.</li>
		<li>Fügen Sie aktives (1 ng/μL, entsprechend 17,2 nM) oder inaktives Lnt (C387S) (2 μL 10 ng/μL Vorrat im Puffer WA mit 0,05% DDM) hinzu und mischen Sie es mit den Substraten (Schritt 2.1.2) durch Pipettieren auf und ab.</li>
		<li>Die Reaktion wird bei 37 °C für 16 h in einem Thermomixer mit beheiztem Deckel inkubiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin-Beschichtung von 96 Well-Platten
	<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung von Streptavidin bei 2 mg/ml inH2Ovor. HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
		<li>Aus der Stammlösung 10 μg/ml Streptavidin in Wasser als Arbeitslösung herstellen. Geben Sie 100 μL der Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Binden Sie Streptavidin an die Platte, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.</li>
	</ol></li>
</ol>HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 2.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 2.4), detektieren Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 2.5).
<ol start="3"><li>Klickchemische Reaktion
	<ol><li>Stammlösungen von Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 50 mM in Wasser hergestellt), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 2 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(50 mM frisch zubereitet inH2O).</li>
		<li>In den 1,5-ml-Röhrchen, die das in Schritt 2.1.4 hergestellte Lnt-Reaktionsgemisch enthalten, wird eine Klickchemie durchgeführt, indem die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt werden: 0,2 μL Stamm Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), 0,4 μL Stamm-TCEP (Endkonzentration 1 mM), 0,2 μL Stamm-TBTA (Endkonzentration 0,02 mM).</li>
		<li>Vortex die Lösung für 5 s. Dann fügen Sie 0,4 μL CuSO4 (Endkonzentration 1 mM) hinzu. Vortex wieder für 5 s. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei RT für 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Bindung von Lnt-Reaktionsgemisch an Streptavidin-beschichtete Platten
	<ol><li>Die Vertiefungen der mit Streptavidin beschichteten Platten werden nach der nächtlichen Inkubation aus Schritt 2.2.2 3x mit 200 μL PBS-T1 (PBS enthält 0,05% Tween-20) gewaschen. HINWEIS: Streptavidinplatten können sofort verwendet oder trocken bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>18 μL aus dem Klick-Chemie-Gemisch aus Schritt 2.3.3 in eine Vertiefung in eine 96-Well-Streptavidin-beschichtete Platte überführen und 100 μL PBS-T1 zugeben, um N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an Streptavidinplatten zu binden.</li>
		<li>Verwenden Sie Biotin-Fluorescein (0,26 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzauslesung.</li>
		<li>Die Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer unter Schütteln bei 300 U/min inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie manuelle Waschschritte der 96 Well-Platten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette wie folgt durch: sechs Waschgänge mit 200 μL PBS-T2 (PBS enthält 1% Tween-20), drei Spülungen mit einer Pipette, drei Spülungen mit 200 μL PBS, drei Spülungen mit einer Pipette.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzdetektion und -analyse
	<ol><li>Fügen Sie 200 μL PBS hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz bei 520 nm in einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader auf. Speichern Sie die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationssoftware. HINWEIS: Biotin-Fluorescein wird als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzdetektion bei 520 nm verwendet. Es wird ein reproduzierbarer Messwert von 30.000–40.000 A.E. mit 0,26 μM Biotin-Fluorescein erwartet. Alle Proben werden in dreifacher Ausfertigung analysiert, einschließlich Kontrollen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Standardabweichung für jede Reaktion und berechnen Sie die P-Werte für Negativkontrollen und positive Proben unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests unter Verwendung einer statistischen Software.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Multiwell-Plattentest
HINWEIS: An Tag 1 die Lnt-Reaktion in 384 Well-Platten (Schritt 3.1) einrichten und 384 Well-Platten mit Streptavidin beschichten (Schritt 3.2).
<ol><li>Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion HINWEIS: Die Menge der Reagenzien und des Enzyms ist im Vergleich zum Röhrchentest reduziert und die Lnt-Reaktion wird direkt in 384 Well-Platten durchgeführt. Dies ermöglicht den Einsatz von weniger Material und eine Reduzierung der Schritte, die weiter automatisiert werden können.<ol><li>Mischen Sie die Substrate wie folgt: Alkin-POPE (Endkonzentration 50 μM aus 500 μM Stoff) und FSL-1-Biotin (endgültige 50 μM aus 500 μM Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Volumen von 13,5 μL pro Reaktion pro Vertiefung in einem 384-Well-Plattenformat. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch. Berechnen Sie die Gesamtmenge an Reagenzien, die für die Anzahl der durchzuführenden Reaktionen erforderlich ist (d. h. 5.184 μL für eine 384-Well-Platte).</li>
		<li>Beschallen Sie die Substratmischung für 3 min in einem Ultraschall-Wasserbad.</li>
		<li>Aliquot 13,5 μL der Substratmischung pro Vertiefung in einer 384-Well-Platte. HINWEIS: Als Negativkontrolle können 10 mM MTSES (625 mM Stammlösung in 100% DMSO) pro Vertiefung hinzugefügt werden. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Puffers ein (Schritt 3.1.1), um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 13,5 μL zu erreichen.</li>
		<li>Vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubieren (Schritt 3.1.5).</li>
		<li>0,5 ng/μL (entsprechend 8,6 nM) aktives Lnt-Enzym oder inaktive Variante (C387S) (1,5 μL aus 5 ng/μL Bestand im Puffer WA mit 0,05% DDM) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) in jede Vertiefung geben, die das Reaktionsgemisch aus Schritt 3.1.3 enthält. Mischen Sie Reagenzien, indem Sie auf und ab pipettieren. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 15 μL.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte mit Kunststofffolie für Multiwell-Platten.</li>
		<li>Bei 37 °C für 16 h in einem Thermomischer mit beheiztem Deckel inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin beschichtet 384 Well-Platten<ol><li>Verwenden Sie 75 μL Streptavidin (10 μg/ml inH2O) aus Schritt 2.2.2, um Vertiefungen einer 384-Well-Platte zu beschichten. Lassen Sie Streptavidin an die Platte binden, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.</li>
	</ol></li>
</ol>HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 3.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 3.4), erkennen Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 3.5).
<ol start="3"><li>Klickchemische Reaktion<ol><li>Stammlösungen von Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 24 mM hergestellt in H2O), TBTA (Tris[(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 0,48 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(24 mM frisch zubereitet inH2O).</li>
		<li>Kombinieren Sie die drei Klickchemie-Reagenzien: eine Mischung aus Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), TCEP (1 mM final) und TBTA (0,02 mM final), jeweils bei 0,75 μL im Endvolumen von 2,25 μL pro Well. Berechnen Sie das erforderliche Volumen pro 384-Well-Platte (d. h. verwenden Sie 864 μL, wenn alle Wells der 384-Well-Platte verwendet werden). Kräftig mischen.</li>
		<li>2,25 μl der Reagenzlösung pro Vertiefung direkt in die fertige Lnt-Reaktion in der 384-Well-Platte aus Schritt 3.1.7 geben.</li>
		<li>Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette.</li>
		<li>CuSO4 (0,75 μL aus 24 mM Bestand für eine Endkonzentration von 1 mM) hinzufügen und durch Pipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette auf und ab mischen.</li>
		<li>Bei RT für 1 h im Dunkeln inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bindung des Lnt-Reaktionsgemisches an Streptavidin-beschichtete 384-Well-Platten
	<ol><li>Die Vertiefungen der Streptavidin-beschichteten Platten nach der nächtlichen Inkubation ab Schritt 3.2.1 1x mit 85 μL PBS-T1 waschen.</li>
		<li>11 μL der Klickchemiereaktion aus jeder Vertiefung der Inkubationsplatte aus Schritt 3.3.6 auf die mit Streptavidin beschichtete Platte aus Schritt 3.4.1 übertragen, um das N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an die Streptavidinplatten zu binden.</li>
		<li>Fügen Sie 64 μL Puffer PBS-T1 hinzu.</li>
		<li>Biotin-Fluorescein (0,19 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Kontrolle für die Bindung an Streptavidin-beschichtete Vertiefungen enthalten.</li>
		<li>Die 384 Well-Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer inkubieren und bei 300 U/min schütteln.</li>
		<li>Waschen Sie die Platten mit einer automatischen Plattenwaschanlage wie folgt: 10 Wäschen mit 85 μL PBS-T2, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt; 5 Wäschen mit 85 μL PBS, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzdetektion und -analyse
	<ol><li>Fügen Sie PBS (85 μL) hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser bei 535 nm auf.</li>
		<li>Analysieren Sie die Daten wie beschrieben (Schritt 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll für den Lnt-Assay, basierend auf der Fluoreszenzdetektion des triacylierten Produkts, ist sensitiv und reproduzierbar. Die spezifische und effiziente Bindung von Biotin an Streptavidin ist ein Schlüsselelement des Assays. Alkin-POPE-Substrat, das nach Abschluss der Lnt-Reaktion übrig bleibt, wird ebenfalls fluoreszierend mit FAM markiert, aber nach der Bindung an die Streptavidinplatten durch mehrere Waschschritte effizient entfernt. Darüber hinaus hat die Zugabe von DMSO keinen Einflu...

Bakterielle Lipoproteine sind durch kovalent gebundene Fettsäuren an ihren Aminotermini gekennzeichnet, durch die sie in Membranenverankert sind 1,2. Der reife Teil des Proteins ist in Struktur und Funktion sehr vielfältig, was die Rolle von Lipoproteinen in verschiedenen biologischen Prozessen in der bakteriellen Zellhülle erklärt.
Lipoproteine werden durch Phospholipid-abgeleitete Fettsäuren nach dem Einbringen in die zytoplasmatische Membran modifiziert. Die Prolipoproteine enthalten ein Signaturmotiv, die Lipobox, die einen invarianten Cysteinrest enthält, der acyliert wird, und die erste Aminosäure im reifen Protein. Der erste Schritt dieses Weges wird durch Prolipoprotein Phosphatidylglycerol::d Iacylglyceryltransferase (Lgt) katalysiert, die die Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein über eine Thioetherverbindung zwischen Diacylglyceryl und Cystein überträgt. Die Signalpeptidase II (Lsp) spaltet das Signalpeptid vom Diacylglyceryl-Prolipoprotein, was zu einem Apolipoprotein führt, das durch seinen Diacylglycerylanteil in der Membran verankert ist. Der dritte und letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert, die eine Fettsäure aus der sn-1-Position des Phospholipids an Apolipoprotein hinzufügt, was zu triacyliertem reifem Lipoprotein führt (Abbildung 1)3. Die Lnt-Reaktion ist eine zweistufige Ping-Pong-Reaktion, bei der ein stabiles Thioester-Acylenzym-Zwischenprodukt gebildet wird. Das Lysophospholipid-Nebenprodukt wird vor der Acylierung des Apolipoproteinsubstrats im zweiten Schritt der Reaktion freigesetzt.
Die Phospholipidsubstratspezifität wird in einem Lnt-Assay basierend auf der Mobilitätsverschiebung des N-Acyldiacylglycerylpeptids auf einem hochprozentigen Tris-Tricin-Harnstoff SDS-PAGE4 bestimmt. Phospholipide mit kleinen polaren Kopfgruppen, gesättigt [sn-1] und nicht gesättigt [sn-2], waren bevorzugte Substrate4. Der Gelverschiebungstest eignet sich weder für umfangreiche kinetische Studien der Apolipoprotein-N-Acyltransferase noch für HTS zur Identifizierung hemmender Moleküle. Die Klickchemie unter Verwendung von Alkinfettsäuren wurde erfolgreich eingesetzt, um die Lipoproteinmodifikation in Bakterien5 und den Fettsäurestoffwechsel in Eukaryoten6 zu untersuchen. Vor kurzem wurde ein In-vitro-Assay der Ras-Palmitoylierung berichtet, um Inhibitoren zu identifizieren7.
Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird gereinigtes aktives Lnt in Waschmittel mit Substraten in gemischten Mizellen inkubiert, um alkintriacyliertes Peptid zu bilden, das anschließend durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Lipoproteine aus Proteobakterien werden posttranslational durch Fettsäuren modifiziert, die aus Membranphospholipiden durch die Wirkung von drei integralen Membranenzymen gewonnen werden, was zu triacylierten Proteinen führt. Der erste Schritt im Lipoproteinmodifikationsweg beinhaltet die Übertragung einer Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein, was zu Diacylglycerylprolipoprotein führt. Im zweiten Schritt wird das Signalpeptid des Prolipoproteins gespalten und bildet ein Apolipoprotein, das wiederum durch eine dritte Fettsäure aus einem Phospholipid modifiziert wird. Dieser letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert. Der Lipoprotein-Modifikationsweg ist in den meisten γ-Proteobakterien essentiell und damit ein potenzielles Ziel für die Entwicklung neuartiger antibakterieller Wirkstoffe. Hier wird ein sensitiver Assay für Lnt beschrieben, der mit dem Hochdurchsatz-Screening kleiner inhibitorischer Moleküle kompatibel ist. Das Enzym und die Substrate sind membraneingebettete Moleküle; Daher ist die Entwicklung eines In-vitro-Tests nicht einfach. Dazu gehören die Reinigung des aktiven Enzyms in Gegenwart von Detergens, die Verfügbarkeit von Alkin-Phospholipiden und Diacylglycerylpeptidsubstraten sowie die Reaktionsbedingungen in gemischten Mizellen. Um den Aktivitätstest in einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) zu verwenden, wird außerdem das direkte Auslesen des Reaktionsprodukts gegenüber gekoppelten enzymatischen Reaktionen bevorzugt. In diesem fluorometrischen Enzymassay wird das alkintriacylierte Peptidprodukt durch eine Klickchemiereaktion fluoreszierend gemacht und in einem Multiwell-Plattenformat detektiert. Diese Methode ist auf andere Acyltransferasen anwendbar, die fettsäurehaltige Substrate verwenden, einschließlich Phospholipide und Acyl-CoA.

Bei der Lnt-Reaktion wird die sn-1-Fettsäure aus Phospholipiden auf ein Diacylglycerylpeptid übertragen, was zu reifem triacyliertem Peptid8 führt. Der hier beschriebene in vitro Lnt-Assay ist darauf ausgelegt, Phospholipide zu verwenden, die eine Alkinfettsäure (Alkin-POPE) und FSL-1-Biotin als Substrate enthalten, was zur Bildung von Alkin-FSL-1-Biotin führt. Bei einer Klickchemiereaktion mit Azido-FAM sollte dieses Produkt fluoreszierend markiert und mittels Fluoreszenzspektrometr...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

1.8K Aufrufe.  Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France. Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Serie: Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...