Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
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Wir danken Fabrice Agou und Alix Boucharlat von der Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) am Institut Pasteur Paris für hilfreiche Vorschläge zum Protokoll, allen Mitgliedern der BGPB-Einheit für Unterstützung und wissenschaftliche Diskussionen und Simon Legood für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wurde von Global Care Initiatives des Instituts Carnot Infektionskrankheiten und des Instituts Carnot Microbes and Health finanziert (15 CARN 0017-01 und 16 CARN 0023-01).

1. Enzym- und Substratzubereitung
<ol><li>Reinigung von Enzymen
	<ol><li>Herstellung und Reinigung des Lnt-Enzyms aus waschmittellöslichen Membranen, wie zuvor beschrieben 4,8. Kurz gesagt, induzieren Sie die Expression des lnt-Strep-Gens, das Lnt mit einem C-terminalen Streptokokken-Tag kodiert, bei OD 600 von 0,6 mit wasserfreiem Tetracyclin (200 ng / ml) bei 37 °C für 16 h.</li>
		<li>Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 10 min und verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet im Puffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) auf 100 OD600 Einheiten pro ml.</li>
		<li>Brechen Sie die Zellen durch zwei Durchgänge durch eine französische Druckzellenpresse bei 10.000 psi.</li>
		<li>Entfernen Sie ungebrochene Zellen und Ablagerungen durch Zentrifugieren bei 13.000 x g für 20 min. Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 120.000 x g für 60 min und sammeln Sie die Membranvesikel (durchscheinendes braun gefärbtes Pellet). Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Lösen Sie die integralen Membranproteine aus dem Membranpellet mit 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-Maltosid (DDM) im Puffer WA für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Zentrifugieren und entfernen Sie unlösliches Material bei 120.000 x g für 30 min. Verwenden Sie die überstehende Fraktion zur Reinigung.</li>
		<li>Lnt-Streptokokken auf einer Affinitätschromatographiesäule (siehe Materialtabelle) und einer S400-Gelfiltrationssäule (siehe Materialtabelle) reinigen, wie von Nozeret et al.8 beschrieben.</li>
		<li>Lagern Sie das gereinigte Enzym im Puffer WA mit 0,05% DDM und 10% Glycerin bei -80 °C. HINWEIS: Das Enzym ist über 5 Jahre stabil.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Alkin-Phospholipid- und biotinylierten Fibroblasten-stimulierenden Liganden (FSL-1-biotin) Substraten
	<ol><li>Aliquot 100 μL kundenspezifisch synthetisiertes Alkin-POPE (1-Hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, siehe Tabelle der Materialien), in Chloroform in 1,5 ml Röhrchen gelöst.</li>
		<li>Durchstechen Sie die Röhrchen mit einer Spritze und verdampfen Sie das Chloroform in einem Speed-Vac bei RT für 2 h. Lagern Sie die trockenen Phospholipidproben bei -20 °C.</li>
		<li>Alkin-POPE vor Gebrauch in 0,1% Triton X-100 bei 500 μM auflösen. Fügen Sie einen 3-minütigen Ultraschallschritt in einem Ultraschall-Wasserbad bei RT hinzu, um Alkin-POPE bei Bedarf zu lösen.</li>
		<li>FSL-1-Biotin in Wasser bei 445 μM resuspendieren. HINWEIS: Beide Lösungen können mindestens 2 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Röhrchen-Assay
HINWEIS: Stellen Sie an Tag 1 die Lnt-Reaktion in 1,5-ml-Röhrchen ein (Schritt 2.1) und beschichten Sie 96 Well-Platten mit Streptavidin (Schritt 2.2).
<ol><li>Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion
	<ol><li>Für einen Standard-Lnt-Assay mischen Sie Alkin-POPE (endgültige 50 μM aus 500 μM-Vorrat) und FSL-1-Biotin (Endkonzentration von 50 μM aus einem 445 μM-Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Endvolumen von 18 μL in 1,5-ml-Röhrchen. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch.</li>
		<li>Die Substratmischung (hergestellt in Schritt 2.1.1) wird 3 min lang in einem Ultraschall-Wasserbad beschallt und vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubiert (Schritt 2.1.3). HINWEIS: MTSES (Natrium(2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonat), ein thiolspezifisches Reagenz, hemmtLnt 8. 10 mM MTSES (100 mM Stammlösung in 100% DMSO) in die Reaktionsröhrchen geben (Schritt 2.1.1), die als Negativkontrollproben verwendet werden sollen. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Reaktionspuffers so ein, dass das Gesamtvolumen 18 μL beträgt.</li>
		<li>Fügen Sie aktives (1 ng/μL, entsprechend 17,2 nM) oder inaktives Lnt (C387S) (2 μL 10 ng/μL Vorrat im Puffer WA mit 0,05% DDM) hinzu und mischen Sie es mit den Substraten (Schritt 2.1.2) durch Pipettieren auf und ab.</li>
		<li>Die Reaktion wird bei 37 °C für 16 h in einem Thermomixer mit beheiztem Deckel inkubiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin-Beschichtung von 96 Well-Platten
	<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung von Streptavidin bei 2 mg/ml inH2Ovor. HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
		<li>Aus der Stammlösung 10 μg/ml Streptavidin in Wasser als Arbeitslösung herstellen. Geben Sie 100 μL der Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Binden Sie Streptavidin an die Platte, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.</li>
	</ol></li>
</ol>HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 2.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 2.4), detektieren Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 2.5).
<ol start="3"><li>Klickchemische Reaktion
	<ol><li>Stammlösungen von Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 50 mM in Wasser hergestellt), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 2 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(50 mM frisch zubereitet inH2O).</li>
		<li>In den 1,5-ml-Röhrchen, die das in Schritt 2.1.4 hergestellte Lnt-Reaktionsgemisch enthalten, wird eine Klickchemie durchgeführt, indem die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt werden: 0,2 μL Stamm Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), 0,4 μL Stamm-TCEP (Endkonzentration 1 mM), 0,2 μL Stamm-TBTA (Endkonzentration 0,02 mM).</li>
		<li>Vortex die Lösung für 5 s. Dann fügen Sie 0,4 μL CuSO4 (Endkonzentration 1 mM) hinzu. Vortex wieder für 5 s. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei RT für 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Bindung von Lnt-Reaktionsgemisch an Streptavidin-beschichtete Platten
	<ol><li>Die Vertiefungen der mit Streptavidin beschichteten Platten werden nach der nächtlichen Inkubation aus Schritt 2.2.2 3x mit 200 μL PBS-T1 (PBS enthält 0,05% Tween-20) gewaschen. HINWEIS: Streptavidinplatten können sofort verwendet oder trocken bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>18 μL aus dem Klick-Chemie-Gemisch aus Schritt 2.3.3 in eine Vertiefung in eine 96-Well-Streptavidin-beschichtete Platte überführen und 100 μL PBS-T1 zugeben, um N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an Streptavidinplatten zu binden.</li>
		<li>Verwenden Sie Biotin-Fluorescein (0,26 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzauslesung.</li>
		<li>Die Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer unter Schütteln bei 300 U/min inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie manuelle Waschschritte der 96 Well-Platten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette wie folgt durch: sechs Waschgänge mit 200 μL PBS-T2 (PBS enthält 1% Tween-20), drei Spülungen mit einer Pipette, drei Spülungen mit 200 μL PBS, drei Spülungen mit einer Pipette.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzdetektion und -analyse
	<ol><li>Fügen Sie 200 μL PBS hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz bei 520 nm in einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader auf. Speichern Sie die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationssoftware. HINWEIS: Biotin-Fluorescein wird als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzdetektion bei 520 nm verwendet. Es wird ein reproduzierbarer Messwert von 30.000–40.000 A.E. mit 0,26 μM Biotin-Fluorescein erwartet. Alle Proben werden in dreifacher Ausfertigung analysiert, einschließlich Kontrollen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Standardabweichung für jede Reaktion und berechnen Sie die P-Werte für Negativkontrollen und positive Proben unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests unter Verwendung einer statistischen Software.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Multiwell-Plattentest
HINWEIS: An Tag 1 die Lnt-Reaktion in 384 Well-Platten (Schritt 3.1) einrichten und 384 Well-Platten mit Streptavidin beschichten (Schritt 3.2).
<ol><li>Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion HINWEIS: Die Menge der Reagenzien und des Enzyms ist im Vergleich zum Röhrchentest reduziert und die Lnt-Reaktion wird direkt in 384 Well-Platten durchgeführt. Dies ermöglicht den Einsatz von weniger Material und eine Reduzierung der Schritte, die weiter automatisiert werden können.<ol><li>Mischen Sie die Substrate wie folgt: Alkin-POPE (Endkonzentration 50 μM aus 500 μM Stoff) und FSL-1-Biotin (endgültige 50 μM aus 500 μM Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Volumen von 13,5 μL pro Reaktion pro Vertiefung in einem 384-Well-Plattenformat. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch. Berechnen Sie die Gesamtmenge an Reagenzien, die für die Anzahl der durchzuführenden Reaktionen erforderlich ist (d. h. 5.184 μL für eine 384-Well-Platte).</li>
		<li>Beschallen Sie die Substratmischung für 3 min in einem Ultraschall-Wasserbad.</li>
		<li>Aliquot 13,5 μL der Substratmischung pro Vertiefung in einer 384-Well-Platte. HINWEIS: Als Negativkontrolle können 10 mM MTSES (625 mM Stammlösung in 100% DMSO) pro Vertiefung hinzugefügt werden. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Puffers ein (Schritt 3.1.1), um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 13,5 μL zu erreichen.</li>
		<li>Vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubieren (Schritt 3.1.5).</li>
		<li>0,5 ng/μL (entsprechend 8,6 nM) aktives Lnt-Enzym oder inaktive Variante (C387S) (1,5 μL aus 5 ng/μL Bestand im Puffer WA mit 0,05% DDM) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) in jede Vertiefung geben, die das Reaktionsgemisch aus Schritt 3.1.3 enthält. Mischen Sie Reagenzien, indem Sie auf und ab pipettieren. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 15 μL.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte mit Kunststofffolie für Multiwell-Platten.</li>
		<li>Bei 37 °C für 16 h in einem Thermomischer mit beheiztem Deckel inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin beschichtet 384 Well-Platten<ol><li>Verwenden Sie 75 μL Streptavidin (10 μg/ml inH2O) aus Schritt 2.2.2, um Vertiefungen einer 384-Well-Platte zu beschichten. Lassen Sie Streptavidin an die Platte binden, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.</li>
	</ol></li>
</ol>HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 3.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 3.4), erkennen Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 3.5).
<ol start="3"><li>Klickchemische Reaktion<ol><li>Stammlösungen von Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 24 mM hergestellt in H2O), TBTA (Tris[(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 0,48 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(24 mM frisch zubereitet inH2O).</li>
		<li>Kombinieren Sie die drei Klickchemie-Reagenzien: eine Mischung aus Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), TCEP (1 mM final) und TBTA (0,02 mM final), jeweils bei 0,75 μL im Endvolumen von 2,25 μL pro Well. Berechnen Sie das erforderliche Volumen pro 384-Well-Platte (d. h. verwenden Sie 864 μL, wenn alle Wells der 384-Well-Platte verwendet werden). Kräftig mischen.</li>
		<li>2,25 μl der Reagenzlösung pro Vertiefung direkt in die fertige Lnt-Reaktion in der 384-Well-Platte aus Schritt 3.1.7 geben.</li>
		<li>Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette.</li>
		<li>CuSO4 (0,75 μL aus 24 mM Bestand für eine Endkonzentration von 1 mM) hinzufügen und durch Pipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette auf und ab mischen.</li>
		<li>Bei RT für 1 h im Dunkeln inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bindung des Lnt-Reaktionsgemisches an Streptavidin-beschichtete 384-Well-Platten
	<ol><li>Die Vertiefungen der Streptavidin-beschichteten Platten nach der nächtlichen Inkubation ab Schritt 3.2.1 1x mit 85 μL PBS-T1 waschen.</li>
		<li>11 μL der Klickchemiereaktion aus jeder Vertiefung der Inkubationsplatte aus Schritt 3.3.6 auf die mit Streptavidin beschichtete Platte aus Schritt 3.4.1 übertragen, um das N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an die Streptavidinplatten zu binden.</li>
		<li>Fügen Sie 64 μL Puffer PBS-T1 hinzu.</li>
		<li>Biotin-Fluorescein (0,19 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Kontrolle für die Bindung an Streptavidin-beschichtete Vertiefungen enthalten.</li>
		<li>Die 384 Well-Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer inkubieren und bei 300 U/min schütteln.</li>
		<li>Waschen Sie die Platten mit einer automatischen Plattenwaschanlage wie folgt: 10 Wäschen mit 85 μL PBS-T2, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt; 5 Wäschen mit 85 μL PBS, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzdetektion und -analyse
	<ol><li>Fügen Sie PBS (85 μL) hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser bei 535 nm auf.</li>
		<li>Analysieren Sie die Daten wie beschrieben (Schritt 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll für den Lnt-Assay, basierend auf der Fluoreszenzdetektion des triacylierten Produkts, ist sensitiv und reproduzierbar. Die spezifische und effiziente Bindung von Biotin an Streptavidin ist ein Schlüsselelement des Assays. Alkin-POPE-Substrat, das nach Abschluss der Lnt-Reaktion übrig bleibt, wird ebenfalls fluoreszierend mit FAM markiert, aber nach der Bindung an die Streptavidinplatten durch mehrere Waschschritte effizient entfernt. Darüber hinaus hat die Zugabe von DMSO keinen Einflu...

Bakterielle Lipoproteine sind durch kovalent gebundene Fettsäuren an ihren Aminotermini gekennzeichnet, durch die sie in Membranenverankert sind 1,2. Der reife Teil des Proteins ist in Struktur und Funktion sehr vielfältig, was die Rolle von Lipoproteinen in verschiedenen biologischen Prozessen in der bakteriellen Zellhülle erklärt.
Lipoproteine werden durch Phospholipid-abgeleitete Fettsäuren nach dem Einbringen in die zytoplasmatische Membran modifiziert. Die Prolipoproteine enthalten ein Signaturmotiv, die Lipobox, die einen invarianten Cysteinrest enthält, der acyliert wird, und die erste Aminosäure im reifen Protein. Der erste Schritt dieses Weges wird durch Prolipoprotein Phosphatidylglycerol::d Iacylglyceryltransferase (Lgt) katalysiert, die die Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein über eine Thioetherverbindung zwischen Diacylglyceryl und Cystein überträgt. Die Signalpeptidase II (Lsp) spaltet das Signalpeptid vom Diacylglyceryl-Prolipoprotein, was zu einem Apolipoprotein führt, das durch seinen Diacylglycerylanteil in der Membran verankert ist. Der dritte und letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert, die eine Fettsäure aus der sn-1-Position des Phospholipids an Apolipoprotein hinzufügt, was zu triacyliertem reifem Lipoprotein führt (Abbildung 1)3. Die Lnt-Reaktion ist eine zweistufige Ping-Pong-Reaktion, bei der ein stabiles Thioester-Acylenzym-Zwischenprodukt gebildet wird. Das Lysophospholipid-Nebenprodukt wird vor der Acylierung des Apolipoproteinsubstrats im zweiten Schritt der Reaktion freigesetzt.
Die Phospholipidsubstratspezifität wird in einem Lnt-Assay basierend auf der Mobilitätsverschiebung des N-Acyldiacylglycerylpeptids auf einem hochprozentigen Tris-Tricin-Harnstoff SDS-PAGE4 bestimmt. Phospholipide mit kleinen polaren Kopfgruppen, gesättigt [sn-1] und nicht gesättigt [sn-2], waren bevorzugte Substrate4. Der Gelverschiebungstest eignet sich weder für umfangreiche kinetische Studien der Apolipoprotein-N-Acyltransferase noch für HTS zur Identifizierung hemmender Moleküle. Die Klickchemie unter Verwendung von Alkinfettsäuren wurde erfolgreich eingesetzt, um die Lipoproteinmodifikation in Bakterien5 und den Fettsäurestoffwechsel in Eukaryoten6 zu untersuchen. Vor kurzem wurde ein In-vitro-Assay der Ras-Palmitoylierung berichtet, um Inhibitoren zu identifizieren7.
Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird gereinigtes aktives Lnt in Waschmittel mit Substraten in gemischten Mizellen inkubiert, um alkintriacyliertes Peptid zu bilden, das anschließend durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen wird.

<table><tbody><tr><td>&amp;Auml;kta Purifier FPLC system</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>alkyne-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Purity: &gt;99%&lt;br/&gt; Lnt substrate</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Purity: 100% (pure)&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td><td>BioTek</td><td>N&amp;deg; serie 115800, n&amp;deg; materiel 405 Select</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Wash steps</td></tr><tr><td>biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Purity: &amp;ge;90%&lt;br/&gt; Fluorescence control</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Purity: &amp;ge;98%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Purity: &amp;ge; 99% &amp;beta;+&amp;alpha;; &amp;lt; 15% &amp;alpha;&lt;br/&gt; Detergent for Lnt purification</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Purity: anhydrous&lt;br/&gt; Solbilization Click reagent</td></tr><tr><td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Handling reagents</td></tr><tr><td>French Pressure Cell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Cell disruption</td></tr><tr><td>FSL-1-biotin</td><td>EMC microcollections</td><td>L7030</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt substrate</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td></tr><tr><td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Purity: ~100%&lt;br/&gt; Thiol specific inhibitor</td></tr><tr><td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Foil to seal multi-well plate</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Purity: &amp;ge;13 units/mg protein&lt;br/&gt; Biotin binding</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Purity: 97%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Purity: &amp;ge;98%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Heated lid</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Purity: 10% in H2O&lt;br/&gt; Lnt reaction buffer</td></tr><tr><td>Ultra centrifuge</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Cell fractionation</td></tr></tbody></table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Lipoproteine aus Proteobakterien werden posttranslational durch Fettsäuren modifiziert, die aus Membranphospholipiden durch die Wirkung von drei integralen Membranenzymen gewonnen werden, was zu triacylierten Proteinen führt. Der erste Schritt im Lipoproteinmodifikationsweg beinhaltet die Übertragung einer Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein, was zu Diacylglycerylprolipoprotein führt. Im zweiten Schritt wird das Signalpeptid des Prolipoproteins gespalten und bildet ein Apolipoprotein, das wiederum durch eine dritte Fettsäure aus einem Phospholipid modifiziert wird. Dieser letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert. Der Lipoprotein-Modifikationsweg ist in den meisten γ-Proteobakterien essentiell und damit ein potenzielles Ziel für die Entwicklung neuartiger antibakterieller Wirkstoffe. Hier wird ein sensitiver Assay für Lnt beschrieben, der mit dem Hochdurchsatz-Screening kleiner inhibitorischer Moleküle kompatibel ist. Das Enzym und die Substrate sind membraneingebettete Moleküle; Daher ist die Entwicklung eines In-vitro-Tests nicht einfach. Dazu gehören die Reinigung des aktiven Enzyms in Gegenwart von Detergens, die Verfügbarkeit von Alkin-Phospholipiden und Diacylglycerylpeptidsubstraten sowie die Reaktionsbedingungen in gemischten Mizellen. Um den Aktivitätstest in einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) zu verwenden, wird außerdem das direkte Auslesen des Reaktionsprodukts gegenüber gekoppelten enzymatischen Reaktionen bevorzugt. In diesem fluorometrischen Enzymassay wird das alkintriacylierte Peptidprodukt durch eine Klickchemiereaktion fluoreszierend gemacht und in einem Multiwell-Plattenformat detektiert. Diese Methode ist auf andere Acyltransferasen anwendbar, die fettsäurehaltige Substrate verwenden, einschließlich Phospholipide und Acyl-CoA.

Bei der Lnt-Reaktion wird die sn-1-Fettsäure aus Phospholipiden auf ein Diacylglycerylpeptid übertragen, was zu reifem triacyliertem Peptid8 führt. Der hier beschriebene in vitro Lnt-Assay ist darauf ausgelegt, Phospholipide zu verwenden, die eine Alkinfettsäure (Alkin-POPE) und FSL-1-Biotin als Substrate enthalten, was zur Bildung von Alkin-FSL-1-Biotin führt. Bei einer Klickchemiereaktion mit Azido-FAM sollte dieses Produkt fluoreszierend markiert und mittels Fluoreszenzspektrometr...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

1.9K Aufrufe.  Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France. Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Serie: Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Forschung

Biochemie

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Biotechnik

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Immunologie und Infektion

Entwicklung eines Click-basierten Assays zum Screening der HAT1-Enzymaktivität

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Acetyl-Click-Assays für das HAT1-Inhibitor-Screening

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Zusammenfassung

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Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung