Ein robuster Plattenleser-Assay wie unserer ist sehr nützlich für das erste Screening potenzieller Methyltransferase-Inhibitoren. Die Möglichkeit, Daten in Echtzeit zu sammeln, ist ein großer Vorteil des kontinuierlichen Endonuklease-gekoppelten Assays. Beginnen Sie mit der Herstellung von 600 Mikrolitern der Assay-Bedingungen, die 20 mikromolare und 50 mikromolare Verbindungen enthalten, separat in den Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
Um dies zu tun, fügen Sie doppelt destilliertes Wasser und 5X Methylierungspuffer zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 1X Methylierungspuffer zu erreichen. Als nächstes fügen Sie 3,15 Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin oder BSA zu jeder Probe hinzu. Dann fügen Sie zwei Mikroliter 3,15 Mikromolare Haarnadel-DNA-Substrat und 1,33 Mikroliter 4,75 Mikromolar S-Adenosylmethionin oder SAM zu jeder Probe hinzu.
Fügen Sie den entsprechenden Proben einen Inhibitor hinzu, um eine Endkonzentration von 21 Mikromolar oder 52,5 Mikromolar und eine äquivalente Menge Dimethylsulfoxid oder DMSO zu einer Kontrollprobe zu erreichen, bevor die Lösungen durch Wirbeln bei 3.000 Umdrehungen pro Minute für drei Sekunden gemischt werden. Dann drehen Sie die Proben für einige Sekunden in einer Tischtisch-Minizentrifuge bei 1, 200 mal G, um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird. Aliquot 95 Mikroliter jeder Assaylösung in sechs aufeinanderfolgende Vertiefungen in einer schwarzen Halbflächen-96-Well-Platte.
75 Mikroliter Gla I oder DNMT1 plus Gla I Enzymlösung in den Mikrozentrifugenröhrchen wie zuvor beschrieben auf eine Endkonzentration von einmaligem Puffer vorbereiten. Als nächstes fügen Sie 1,2 Mikroliter von 10 Einheiten pro Mikroliter Gla I zu jeder Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,16 Einheiten pro Mikroliter zu erreichen. Fügen Sie der Lösung DNMT1 plus Gla I 0,6 Mikroliter von fünf mikromolaren RFTS-fehlenden DNMT1 hinzu, um eine Endkonzentration von 40 Nanomolaren zu erhalten.
Nach dem vorsichtigen Mischen drehen Sie die Proben einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge bei 1.200 g, um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird. Dann aliquot 12 Mikroliter jeder Enzymlösung in sechs Vertiefungen in einer konischen 96-Well-Platte. Für den Methylierungstest der DNA-Probe wird der Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorgeheizt.
Legen Sie dann die schwarze Platte mit den Assaylösungen in das Plattenlesegerät ein. Nach dem Schütteln der Platte bei 425 CPM wird die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 528 Nanometern gemessen. Dann die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.
Entfernen Sie die Assay-Platte aus dem Plattenleser und fügen Sie fünf Mikroliter der Enzymlösung in jede Vertiefung hinzu, gefolgt von einem Mischen der Lösung durch Pipettieren auf und ab. Führen Sie die Platte in das Plattenlesegerät ein und schütteln Sie die Platte, bevor Sie die Fluoreszenz alle 53 Sekunden für 30 Minuten aufzeichnen. Man erhält die durchschnittliche Fluoreszenz der dreifachen Gla I-Kontrollassays für jede Bedingung und subtrahiert die durchschnittlichen Gla I-haltigen Kontrollreaktionsschalen von den dreifachen Spuren, die in Gegenwart von RFTS-fehlendem DNMT1 erhalten wurden.
Bestimmen Sie dann den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts für die korrigierten Replikate. Zeichnen Sie die durchschnittlich korrigierte Reaktionsspur und passen Sie den anfänglichen linearen Abschnitt an eine Linie an, um die Anfangsgeschwindigkeit zu bestimmen. Bestimmen Sie die prozentuale Aktivität, indem Sie die in Gegenwart einer Verbindung beobachtete Geschwindigkeit durch die Geschwindigkeit dividieren, die in der DMSO-haltigen Kontrollreaktion beobachtet wurde, und mit 100 multiplizieren.
Die Ergebnisse eines diskontinuierlichen Endonuklease-gekoppelten Assays zeigten, dass vollständig methylierte Produkt-DNA vor Spaltung geschützt ist, was bestätigt, dass RFTS-fehlendes DNMT1 aktiv ist und in der Lage ist, die hemimethylierte Substrat-DNA zu methylieren. Im fluoreszenzbasierten Assay hatte die Zugabe von DNMT1 oder Puffer allein in Abwesenheit von Gla I keinen Einfluss auf die Hintergrundfluoreszenz. Die anschließende Zugabe von Gla I zu allen Assays führte zu einer Fluoreszenzerzeugung nur in Assays, die DNMT1 enthielten.
Die gleichzeitige Zugabe von RFTS-fehlendem DNMT1 und Gla I zu drei Assays führte zu einer robusten Fluoreszenzerzeugung. Die Zugabe von Gla I allein erzeugte keine Fluoreszenz. Um nach potenziellen Inhibitoren zu suchen, wurde die DNA-Methylierungsaktivität von RFTS-fehlendem DNMT1 in Gegenwart von DMSO, Verbindung eins, Verbindung zwei oder Verbindung drei bei 20 und 50 Mikromolkonzentrationen untersucht.
Die Verbindungen, die die Fluoreszenzerzeugung in diesem gekoppelten Assay reduzieren, müssen weiter validiert werden. Sicherzustellen, dass die Verbindungen das Kopplungsenzym nicht hemmen, ist ein wichtiger nächster Schritt.
