파리시 파스퇴르 연구소의 기술 자원 및 연구 센터(C2RT)의 화학유전체 및 생물학적 스크리닝 플랫폼의 Fabrice Agou와 Alix Boucharlat에게 프로토콜에 대한 유용한 제안, 지원 및 과학적 토론을 위한 BGPB 부서의 모든 구성원, 원고를 비판적으로 읽어준 Simon Legood에게 감사드립니다. 작업은 Carnot 전염병 연구소와 Carnot 미생물 및 건강 연구소의 Global Care Initiatives (15 CARN 0017-01 및 16 CARN 0023-01)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 효소 및 기질 준비
<ol><li>효소의 정제
	<ol><li>앞서 설명한 대로 세제 가용화된 막으로부터 Lnt 효소를 생산하고 정제합니다 4,8. 간단히 말해서, 37°C에서 16시간 동안 무수 테트라사이클린(200ng/mL)으로 0.6의 OD600에서 C-말단 스트렙 태그로 Lnt를 암호화하는 lnt-연쇄상 구균 유전자의 발현을 유도합니다.</li>
		<li>4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 상청액을 버린다.</li>
		<li>세포 펠렛을 mL당 100 OD600 유닛으로 완충액 WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중에 재현탁시킨다.</li>
		<li>10,000 psi에서 프렌치 압력 셀 프레스를 통해 2계대로 세포를 분해한다.</li>
		<li>13,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 끊어지지 않은 세포와 파편을 제거합니다. 상청액을 보관하고 펠릿을 폐기하십시오.</li>
		<li>상청액을 120,000 x g 에서 60분 동안 원심분리하고 막 소포(반투명 갈색 컬러 펠릿)를 수집한다. 상청액을 폐기하십시오.</li>
		<li>막 펠릿의 통합 막 단백질을 완충액 WA의 1%(w/v) n-도데실 β-D-말토사이드(DDM)로 실온(RT)에서 30분 동안 가용화합니다. 원심분리하고 불용화된 물질을 120,000 x g 에서 30분 동안 제거합니다. 정제를 위해 상청액 분획을 사용하십시오.</li>
		<li>Nozeret et al.8에 설명된 대로 친화성 크로마토그래피 컬럼(재료 표 참조) 및 S400 겔 여과 컬럼(재료 표 참조)에서 Lnt-연쇄상 구균을 정제합니다.</li>
		<li>정제된 효소를 -80°C에서 0.05% DDM 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 WA에 저장한다. 알림: 효소는 5 년 이상 안정적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>알킨-인지질 및 비오티닐화 섬유아세포 자극 리간드(FSL-1-비오틴) 기질의 제조
	<ol><li>100 μL의 맞춤 합성 알킨-POPE (1- 헥사 덱 -15- 이노일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 재료 표 참조)를 클로로포름에 1.5mL 튜브에 가용화했습니다.</li>
		<li>주사기로 튜브를 관통하고 RT에서 2 시간 동안 속도 진공에서 클로로포름을 증발시킵니다. 건조 인지질 샘플을 -20°C에서 보관한다.</li>
		<li>사용하기 전에 500 μM에서 0.1% 트리톤 X-100에 알킨-POPE를 용해시킵니다. 필요한 경우 알킨-POPE를 가용화하기 위해 RT의 초음파 수조에서 3분 초음파 처리 단계를 추가합니다.</li>
		<li>FSL-1-비오틴을 445μM의 물에 재현탁합니다. 알림: 두 용액 모두 -20°C에서 최소 2개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 튜브 분석
참고: 1일째에 Lnt 반응을 1.5mL 튜브에 설정하고(2.1단계) 96웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(2.2단계).
<ol><li>시약 혼합물의 제조 및 효소 반응
	<ol><li>표준 Lnt 분석의 경우, Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100)에 알킨-POPE (50 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (445 μM 스톡으로부터 50 μM의 최종 농도)을 1.5 mL 튜브에서 18 μL의 최종 부피로 혼합한다. 모든 조건을 세 번 수행하십시오.</li>
		<li>기질 혼합물 (단계 2.1.1에서 제조)을 초음파 수조에서 3 분 동안 초음파 처리하고 Lnt 효소 (단계 2.1.3)를 첨가하기 전에 37 °C에서 5 분 동안 배양한다. 참고: 티올 특이적 시약인 MTSES(나트륨(2-설포나토에틸)메탄티오설포네이트)는 Lnt8을 억제합니다. 음성 대조군 샘플로 사용할 반응 튜브(단계 2.1.1)에 10mM MTSE(100% DMSO 중 100mM 스톡 용액)를 추가합니다. 총 부피가 18 μL가 되도록 Lnt 반응 완충액의 부피를 조정합니다.</li>
		<li>활성(1ng/μL, 17.2nM에 해당) 또는 비활성 Lnt(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 버퍼 WA에 10ng/μL 스톡 2μL)를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 기질과 혼합합니다(단계 2.1.2).</li>
		<li>반응물을 가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 16시간 동안 37°C에서 인큐베이션합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96웰 플레이트의 스트렙타비딘 코팅
	<ol><li>H2O에서 2 mg / mL의 스트렙 타비딘 저장 용액을 준비하십시오. 알림: 이 용액은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>스톡 용액에서 작업 용액으로 물에 10μg/mL 스트렙타비딘을 준비합니다. 100 μL의 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 인큐베이션하여 플레이트에 결합시켜 웰을 공기 건조시켰다.</li>
	</ol></li>
</ol>참고: 2일째에 클릭 화학(2.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(2.4단계) 형광을 검출하고 결과를 분석합니다(단계 2.5).
<ol start="3"><li>클릭-화학 반응
	<ol><li>아지도-FAM (DMSO 중 5 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; 물에서 제조된 50 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 2 mM 중 tert-부탄올:DMSO (4:1)), 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된50mM)의 원액을 준비한다.</li>
		<li>단계 2.1.4에서 제조된 Lnt 반응 혼합물을 포함하는 1.5 mL 튜브에, 다음 순서로 시약을 첨가하여 클릭 화학을 수행한다: 0.2 μL 스톡 아지도-FAM (최종 농도 50 μM), 0.4 μL 스톡 TCEP (최종 농도 1 mM), 0.2 μL 스톡 TBTA (최종 농도 0.02 mM).</li>
		<li>용액을 5 초 동안 소용돌이. 이어서 0.4 μL의 스톡CuSO4 (최종 농도 1 mM)를 첨가한다. 5 초 동안 다시 소용돌이. 샘플을 RT의 어둠 속에서 1 시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합
	<ol><li>2.2.2 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 200 μL의 PBS-T1(0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3x 세척한다. 알림: 스트렙타비딘 플레이트는 즉시 사용하거나 4°C에서 건조한 상태로 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>단계 2.3.3의 클릭 화학 혼합물에서 18μL를 96웰 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 웰로 옮기고 100μL의 PBS-T1을 추가하여 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킵니다.</li>
		<li>비오틴-플루오레세인(DMSO의 3.1mM 스톡에서 0.26μM)을 스트렙타비딘 결합 및 형광 판독을 위한 양성 대조군으로 사용합니다.</li>
		<li>플레이트를 RT에서 열혼합기의 어둠 속에서 1시간 동안 배양하고 300rpm으로 흔들어줍니다.</li>
		<li>다음과 같이 다채널 전동 피펫으로 96웰 플레이트의 수동 세척 단계를 수행합니다: 200μL의 PBS-T2(1% Tween-20을 포함하는 PBS)로 6회 세척, 피펫으로 3회 세척, 200μL의 PBS로 3회 세척, 피펫으로 3회 세척.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 검출 및 분석
	<ol><li>200 μL의 PBS를 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더에서 520 nm에서의 형광을 기록하였다. 스프레드시트 소프트웨어에 결과를 저장합니다. 참고: 비오틴-플루오레세인은 520nm에서 스트렙타비딘 결합 및 형광 검출을 위한 양성 대조군으로 사용됩니다. 0.26 μM 비오틴-플루오레세인으로 30,000–40,000 AU의 재현 가능한 판독값이 예상됩니다. 모든 샘플은 대조군을 포함하여 삼중으로 분석됩니다.</li>
		<li>각 반응에 대한 표준 편차를 계산하고 통계 소프트웨어를 사용하여 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 음성 대조군과 양성 표본에 대한 P-값을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 멀티웰 플레이트 분석
참고: 1일째에 384웰 플레이트(단계 3.1)에서 Lnt 반응을 설정하고 384웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(단계 3.2).
<ol><li>시약 혼합물의 제조 및 효소 반응 참고: 시약과 효소의 양은 튜브 분석에 비해 감소하고 Lnt 반응은 384웰 플레이트에서 직접 수행됩니다. 이를 통해 재료를 덜 사용하고 추가로 자동화 할 수있는 단계를 줄일 수 있습니다.<ol><li>기질을 다음과 같이 혼합한다: Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100) 중 알킨-POPE (500 μM 스톡으로부터 최종 농도 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (500 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 384 웰 플레이트 형식으로 웰당 반응당 13.5 μL의 부피로. 모든 조건을 세 번 수행하십시오. 수행할 반응 수에 필요한 시약의 총량을 계산합니다(즉, 384웰 플레이트 1개에 대해 5,184μL).</li>
		<li>초음파 수조에서 3 분 동안 기질 혼합물을 초음파 처리하십시오.</li>
		<li>384 웰 플레이트에서 웰당 기질 혼합물의 13.5 μL를 분취한다. 참고: 음성 대조군으로 웰당 10mM의 MTSES(100% DMSO 중 625mM 스톡 용액)를 추가할 수 있습니다. Lnt 완충액의 부피(단계 3.1.1)를 조정하여 최종 반응 부피 13.5μL에 도달합니다.</li>
		<li>Lnt 효소를 첨가하기 전에 37°C에서 5분 동안 배양한다(단계 3.1.5).</li>
		<li>Lnt 반응 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA)에 0.5ng/μL(8.6nM에 해당) 활성 Lnt 효소 또는 불활성 변이체(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 완충액 WA의 5ng/μL 재고에서 1.5μL)를 단계 3.1.3의 반응 혼합물을 포함하는 각 웰에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 시약을 혼합합니다. 총 반응 부피는 15 μL이다.</li>
		<li>멀티웰 플레이트용 플라스틱 호일로 플레이트를 밀봉합니다.</li>
		<li>가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스트렙타비딘 코팅 384웰 플레이트<ol><li>2.2.2단계의 스트렙타비딘 75μL(H2O중 10μg/mL)를 사용하여 384웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 배양하여 플레이트에 결합시켜 웰을 자연 건조시킨다.</li>
	</ol></li>
</ol>참고: 2일째에 클릭 화학(3.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(3.4단계), 형광을 감지하고 결과를 분석합니다(단계 3.5).
<ol start="3"><li>클릭-화학 반응<ol><li>아지도-FAM (DMSO 중 1.2 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; H2O에서 제조된 24 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 3급-부탄올에서 0.48 mM:DMSO (4:1)) 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된 24mM)의 스톡 용액을 준비한다.</li>
		<li>Azido-FAM(최종 농도 50μM), TCEP(최종 1mM) 및 TBTA(최종 0.02mM)의 혼합물인 Azido-FAM(최종 농도 50μM), 웰당 최종 부피 2.25μL에서 각각 0.75μL의 혼합물의 세 가지 클릭 화학 시약을 결합합니다. 384 웰 플레이트 당 필요한 부피를 계산합니다 (즉, 384 웰 플레이트의 모든 웰이 사용되는 경우 864 μL 사용). 격렬하게 섞는다.</li>
		<li>웰당 2.25 μL의 시약 용액을 3.1.7 단계에서 완료된 384 웰 플레이트의 Lnt 반응에 직접 추가합니다.</li>
		<li>멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>CuSO4(1mM 최종 농도에 대해 24mM 스톡에서 0.75μL)를 추가하고 멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅된 384웰 플레이트에 결합
	<ol><li>1x 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 85 μL PBS-T1로 1x 세척한다.</li>
		<li>11μL의 클릭-화학 반응을 단계 3.3.6의 인큐베이션 플레이트의 각 웰로부터 단계 3.4.1로부터의 스트렙타비딘-코팅된 플레이트로 옮겨 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킨다.</li>
		<li>64 μL의 버퍼 PBS-T1을 추가합니다.</li>
		<li>스트렙타비딘-코팅된 웰에 결합하기 위한 대조군으로서 비오틴-플루오레세인(DMSO 내의 3.1 mM 스톡으로부터 0.19 μM)을 포함한다.</li>
		<li>384웰 플레이트를 RT에서 1시간 동안 열혼합기에서 300rpm으로 진탕하면서 배양합니다.</li>
		<li>다음과 같이 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하십시오 : 85 μL PBS-T2로 10 회 세척, 세척 사이에 플레이트를 흔들어줍니다. 85 μL PBS로 5회 세척하고, 세척 사이에 플레이트를 진탕한다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 검출 및 분석
	<ol><li>PBS(85μL)를 추가하고 535nm의 형광 마이크로플레이트 리더에 형광을 기록합니다.</li>
		<li>설명된 대로 데이터를 분석합니다(2.5.2단계).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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여기에 설명된 Lnt 분석을 위한 프로토콜은 트리아실화된 생성물의 형광 검출을 기반으로 민감하고 재현 가능합니다. 비오틴과 스트렙타비딘의 특이적이고 효율적인 결합은 분석의 핵심 요소입니다. Lnt 반응 완료 후 남은 알킨-POPE 기질은 또한 FAM으로 형광 표지되지만 여러 세척 단계에 의해 스트렙타비딘 플레이트 상에 결합한 후 효율적으로 제거된다. 또한, DMSO의 첨가는 Lnt 활성에 영향을 미치?...

박테리아 지단백질은 아미노 말단에서 공유 결합 지방산이 특징이며,이를 통해 막 1,2에 고정됩니다. 단백질의 성숙한 부분은 구조와 기능이 매우 다양하여 박테리아 세포 외피의 다양한 생물학적 과정에서 지단백질의 역할을 설명합니다.
지단백질은 세포질 막에 삽입 된 후 인지질 유래 지방산에 의해 변형됩니다. 프로리포단백질은 시그니처 모티프인 리포박스(lipobox)를 함유하고 있으며, 리포박스는 아실화되는 불변 시스테인 잔기와 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산을 포함합니다. 이 경로의 첫 번째 단계는 프로리포단백질 포스파티딜글리세롤::d이아실글리세릴 트랜스퍼라제(Lgt)에 의해 촉매되며, 이는 디아실글리세릴과 시스테인 사이의 티오에테르 연결을 통해 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴 그룹을 전달합니다. 신호 펩티다아제 II(Lsp)는 디아실글리세릴 프로리포단백질로부터 신호 펩티드를 절단하여, 디아실글리세릴 부분을 통해 막에 고정된 아포지단타인을 생성한다. 세 번째이자 마지막 단계는 인지질의 sn-1 위치에서 지방산을 아포지단백질에 추가하여 삼아실화된 성숙한 지단백질을 생성하는 아포지단백 N-아실트랜스퍼라제(Lnt)에 의해 촉매됩니다(그림 1)3. Lnt 반응은 안정한 티오에스테르 아실 효소 중간체가 형성되는 2단계 탁구 반응입니다. 리소포지질 부산물은 반응의 제2 단계에서 아포지단백질 기질의 아실화 전에 방출된다.
인지질 기질 특이성은 높은 비율의 트리스-트리신 우레아 SDS-PAGE4에 대한 N-아실 디아실글리세릴 펩티드의 이동성 이동에 기초한 Lnt 분석에서 결정된다. 포화 [sn-1] 및 불포화 [sn-2]의 작은 극성 헤드 그룹을 갖는 인지질이 바람직한 기질4이었다. 겔 이동 분석은 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제의 광범위한 동역학 연구 나 HTS가 억제 분자를 식별하는 데 적합하지 않습니다. 알킨 지방산을 사용한 클릭 화학은 박테리아5 의 지단백질 변형과 진핵 생물6의 지방산 대사를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 최근에, 라스 팔미토일화의 시험관내 분석이 억제제7을 확인하기 위해 보고되었다.
여기에 설명된 방법에서, 세제 중 정제된 활성 Lnt는 혼합 미셀 내의 기질과 함께 인큐베이션되어 알킨-트리아실화된 펩티드를 형성하고, 이 펩타이드는 후속적으로 형광 분광법에 의해 검출된다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

프로테오박테리아의 지단백질은 3개의 통합 막 효소의 작용에 의해 막 인지질에서 파생된 지방산에 의해 번역 후 변형되어 트리아실화 단백질을 생성합니다. 지단백질 변형 경로의 첫 번째 단계는 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴기를 전달하여 디아실글리세릴 프롤리포단백질을 생성하는 것입니다. 두 번째 단계에서, 프롤리포 단백질의 신호 펩티드는 절단되어 아포지 단백질을 형성하고, 이는 차례로 인지질로부터 유래 된 제 3 지방산에 의해 변형된다. 이 마지막 단계는 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제 (Lnt)에 의해 촉매됩니다. 지단백질 변형 경로는 대부분의 γ-프로테오박테리아에서 필수적이므로 새로운 항균제 개발을 위한 잠재적인 표적이 됩니다. 여기에 설명된 것은 작은 억제 분자의 고처리량 스크리닝과 호환되는 Lnt에 대한 민감한 분석입니다. 효소와 기질은 막에 매립된 분자입니다. 따라서 체외 테스트의 개발은 간단하지 않습니다. 여기에는 세제의 존재 하에서 활성 효소의 정제, 알킨-인지질 및 디아실글리세릴 펩티드 기질의 가용성, 혼합 미셀에서의 반응 조건이 포함됩니다. 또한, 고처리량 스크리닝(HTS) 설정에서 활성 테스트를 사용하려면 결합 효소 반응보다 반응 생성물의 직접 판독이 선호됩니다. 이 형광 효소 분석에서 알킨-트리아실화 펩타이드 생성물은 클릭-화학 반응을 통해 형광으로 렌더링되고 멀티웰 플레이트 형식으로 검출됩니다. 이 방법은 인지질 및 아실 -CoA를 포함한 지방산 함유 기질을 사용하는 다른 아실 트랜스퍼 라제에 적용 할 수 있습니다.

Lnt 반응에서 인지질의 sn-1 지방산은 디아실글리세릴 펩티드로 옮겨져 성숙한 트리아실화 펩티드8을 생성합니다. 여기에 설명된 시험관 내 Lnt 분석은 알킨 지방산(알킨-POPE) 및 FSL-1-비오틴을 기질로 함유하는 인지질을 사용하여 알킨-FSL-1-비오틴을 형성하도록 설계되었습니다. azido-FAM과의 클릭 화학 반응 시 이 제품은 형광 표지를 거쳐 형광 분광법으로 검출되어야 합니다(...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

1.8K 조회수.  Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France. 여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

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High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

dNTPase SAMHD1과의 저분자 상호작용을 프로브하기 위한 고처리량 효소 결합 활성 분석

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

단백질 결정화를 위한 고처리량 스크리닝

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

저자 스포트라이트: 단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...