Kemogenomik ve Biyolojik Tarama Platformu'ndan Fabrice Agou ve Alix Boucharlat'a, Institut Pasteur Paris'teki Teknolojik Kaynaklar ve Araştırma Merkezi'ne (C2RT) protokol hakkında yararlı öneriler için, BGPB Birimi'nin tüm üyelerine destek ve bilimsel tartışmalar için ve Simon Legood'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma, Carnot Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Carnot Mikropları ve Sağlığı Enstitüsü'nün Küresel Bakım Girişimleri (15 CARN 0017-01 ve 16 CARN 0023-01) tarafından finanse edilmiştir.

1. Enzim ve substrat hazırlama
<ol><li>Enzimin saflaştırılması
	<ol><li>Lnt enzimini daha önce tarif edildiği gibi deterjanda çözünür membranlardan üretin ve saflaştırın 4,8. Kısaca, Lnt-strep geninin ekspresyonunu indükleyin, Lnt'yi bir C-terminal Strep etiketi ile kodlayın, OD600'de 0.6'da 16 saat boyunca 37 ° C'de susuz tetrasiklin (200 ng / mL) ile.</li>
		<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini tampon WA'da (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) mL başına 100 OD600 birime kadar yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücreleri, 10.000 psi'de bir Fransız basınçlı hücre presinden iki geçitle kırın.</li>
		<li>Kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 20 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin. Süpernatantı saklayın ve peleti atın.</li>
		<li>Süpernatantı 60 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj yapın ve membran veziküllerini (yarı saydam kahverengi renkli pelet) toplayın. Süper natantı atın.</li>
		<li>Membran peletinden integral membran proteinlerini, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca tampon WA'da% 1 (w/v) n-Dodesil β-D-maltosid (DDM) ile çözündürün. Çözünmeyen malzemeyi 120.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın ve çıkarın. Saflaştırma için süpernatant fraksiyonu kullanın.</li>
		<li>Lnt-strep'i Nozeret ve ark.8 tarafından açıklandığı gibi bir afinite kromatografisi sütununda (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir S400 jel filtrasyon sütununda (bkz.</li>
		<li>Saflaştırılmış enzimi, -80 °C'de% 0.05 DDM ve% 10 gliserol içeren tampon WA'da saklayın. NOT: Enzim 5 yıldan fazla bir süredir stabildir.</li>
	</ol></li>
	<li>Alkin-fosfolipid ve biyotinile Fibroblast Uyarıcı Ligand (FSL-1-biotin) substratlarının hazırlanması
	<ol><li>Aliquot 100 μL özel sentezlenmiş alkin-POPE (1-hekzade-15-ynoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, bakınız Malzeme Tablosu) kloroformda 1.5 mL tüplere çözünür.</li>
		<li>Tüpleri bir şırınga ile delin ve kloroformu RT'de 2 saat boyunca bir hız boşluğunda buharlaştırın. Kuru fosfolipit örneklerini -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Kullanmadan önce alkin-PAPE'yi 500 μM'de% 0.1 Triton X-100'de çözün. Gerekirse alkin-POPE'yi çözündürmek için RT'de ultrasonik su banyosuna 3 dakikalık bir sonikasyon adımı ekleyin.</li>
		<li>FSL-1-biyotin'i suda 445 μM'de yeniden askıya alın. NOT: Her iki çözelti de -20 °C'de en az 2 ay saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tüp testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 1,5 mL tüplerde ayarlayın (adım 2.1) ve 96 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 2.2).
<ol><li>Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
	<ol><li>Standart bir Lnt testi için, 1,5 mL tüplerde 18 μL'lik son hacimde alkin-POPE (500 μM stoktan son 50 μM) ve FSL-1-biyotin (445 μM stoktan 50 μM nihai konsantrasyon) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %1 BSA içeren %0.1 Triton X-100) karıştırın. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Substrat karışımını (adım 2.1.1'de hazırlanan) ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin ve Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 2.1.3). NOT: MTSES (sodyum (2-sülfonatoetil)metanetiosülfonat), tiol-spesifik bir reaktif, Lnt8'i inhibe eder. Negatif kontrol numuneleri olarak kullanılmak üzere reaksiyon tüplerine (adım 2.1.1) 10 mM MTSES (% 100 DMSO'da 100 mM stok çözeltisi) ekleyin. Lnt reaksiyon tamponunun ses seviyesini toplam hacim 18 μL olacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Aktif (1 ng/μL, 17,2 nM'ye karşılık gelir) veya inaktif Lnt (C387S) (%0,05 DDM içeren tampon WA'da 10 ng/μL'lik 2 μL) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle indirerek substratlarla (adım 2.1.2) karıştırın.</li>
		<li>Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>96 kuyu plakasının Streptavidin kaplaması
	<ol><li>H2O'da 2 mg / mL'de bir streptavidin stok çözeltisi hazırlayın. NOT: Bu çözelti -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.</li>
		<li>Stok çözeltisinden, çalışma çözeltisi olarak suda 10 μg / mL streptavidin hazırlayın. 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna 100 μL çözelti ekleyin. Kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 °C'de inkübe ederek streptavidin'i plakaya bağlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 2.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 2.4) ve floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 2.5).
<ol start="3"><li>Klik-kimya reaksiyonu
	<ol><li>Azido-FAM (DMSO'da 5 mM), TCEP (Tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; suda hazırlanan 50 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 2 mM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H2O (H2O'da taze hazırlanmış 50 mM) stok çözeltileri hazırlayın.</li>
		<li>Adım 2.1.4'te hazırlanan Lnt reaksiyon karışımını içeren 1,5 mL'lik tüplerde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyerek klik-kimyası gerçekleştirin: 0,2 μL stok Azido-FAM (nihai konsantrasyon 50 μM), 0,4 μL stok TCEP (nihai konsantrasyon 1 mM), 0,2 μL stok TBTA (nihai konsantrasyon 0,02 mM).</li>
		<li>Vorteks 5 s için çözüm. Daha sonra 0,4 μL stok CuSO4 (son konsantrasyon 1 mM) ekleyin. 5 s için tekrar vorteks. Örnekleri karanlıkta RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı plakalara bağlanması
	<ol><li>Streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını, 2.2.2 3x adımından bir gecede inkübasyondan sonra 200 μL PBS-T1 (% 0.05 Ara-20 içeren PBS) ile yıkayın. NOT: Streptavidin plakalar hemen kullanılabilir veya 4 °C'de kuru olarak saklanabilir.</li>
		<li>Klik-kimya karışımından 18 μL'yi adım 2.3.3'ten 96 kuyu streptavidin kaplı bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve N-açil-FSL-1-biyotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için 100 μL PBS-T1 ekleyin.</li>
		<li>Streptavidin bağlama ve floresan okuması için pozitif kontrol olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3.1 m'lik bir stoktan 0.26 μM) kullanın.</li>
		<li>RT'deki plakaları karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin, 300 rpm'de sallayın.</li>
		<li>96 kuyucuk plakasının manuel yıkama adımlarını çok kanallı elektronik pipetle aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 200 μL PBS-T2 ile altı yıkama (%1 Ara-20 içeren PBS), pipetle üç yıkama, 200 μL PBS ile üç yıkama, pipetle üç yıkama.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan algılama ve analizi
	<ol><li>200 μL PBS ekleyin ve floresanı bir floresan mikroplaka okuyucusuna 520 nm'de kaydedin. Sonuçları e-tablo yazılımına kaydedin. NOT: Biotin-floresein, streptavidin bağlama ve 520 nm'de floresan tespiti için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. 0.26 μM biyotin-floresein ile 30.000-40.000 A.U.'nun tekrarlanabilir bir okuması beklenmektedir. Tüm numuneler, kontroller de dahil olmak üzere üçlü olarak analiz edilir.</li>
		<li>İstatistiksel bir yazılım kullanarak eşleşmemiş t-testini kullanarak her reaksiyon için standart sapmayı ve negatif kontroller ve pozitif numuneler için P-değerlerini hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Çok kuyulu plaka testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 384 kuyu plakasında (adım 3.1) ayarlayın ve 384 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 3.2).
<ol><li>Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon NOT: Reaktiflerin ve enzimin miktarı, tüp testine kıyasla azaltılır ve Lnt reaksiyonu doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirilir. Bu, daha az malzeme kullanılmasına ve daha da otomatikleştirilebilecek adımların azaltılmasına izin verir.<ol><li>Substratları aşağıdaki gibi karıştırın: alkin-POPE (500 μM stoktan son konsantrasyon 50 μM) ve FSL-1-biyotin (500 μM stoktan son 50 μM) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl,% 1 BSA içeren% 0.1 Triton X-100) 384 kuyu plakası formatında kuyu başına reaksiyon başına 13.5 μL hacimde. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin. Gerçekleştirilecek reaksiyon sayısı için gereken toplam reaktif miktarını hesaplayın (yani, bir 384 kuyu plakası için 5.184 μL).</li>
		<li>Substrat karışımını ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin.</li>
		<li>384 kuyucuklu bir plakada kuyu başına substrat karışımının Aliquot 13.5 μL'si. NOT: Negatif kontrol olarak, kuyu başına 10 mM MTSES (%100 DMSO'da 625 mM stok çözeltisi) eklenebilir. 13,5 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için Lnt tamponunun ses seviyesini (adım 3.1.1) ayarlayın.</li>
		<li>Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 3.1.5).</li>
		<li>3.1.3. adımdan itibaren reaksiyon karışımını içeren her bir kuyucuğa Lnt reaksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %0.1 Triton X-100, %1 BSA) 0,5 ng/μL (8,6 nM'ye karşılık gelen) aktif Lnt enzimi veya inaktif varyant (C387S) (% 0,05 DDM içeren tampon WA'daki 5 ng/μL stoktan 1,5 μL) ekleyin. Reaktifleri yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın. Toplam reaksiyon hacmi 15 μL'dir.</li>
		<li>Çok kuyulu plakalar için plakayı plastik folyo ile kapatın.</li>
		<li>Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin kaplama 384 kuyu plakaları<ol><li>384 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için 2.2.2 adımından itibaren 75 μL streptavidin (H 2 O'da 10 μg / mL) kullanın. Streptavidin, kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek plakaya bağlanmasına izin verin.</li>
	</ol></li>
</ol>NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 3.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 3.4), floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 3.5).
<ol start="3"><li>Klik-kimya reaksiyonu<ol><li>Azido-FAM (DMSO'da 1.2 mM), TCEP (tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; H 2 O'da hazırlanan 24 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 0.48 mMM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H 2 O(H2O'da taze hazırlanmış24mM) stok çözeltilerini hazırlayın.</li>
		<li>Üç klik-kimya reaktifini birleştirin: Azido-FAM (son konsantrasyon 50 μM), TCEP (1 mM final) ve TBTA (0.02 mM final) karışımı, her biri kuyucuk başına 2.25 μL'lik son hacimde 0.75 μL'de. 384 kuyu plakası başına gerekli hacmi hesaplayın (yani, 384 kuyu plakasının tüm kuyuları kullanıldığında 864 μL kullanın). Kuvvetlice karıştırın.</li>
		<li>3.1.7 adımından itibaren 384 kuyu plakasındaki tamamlanmış Lnt reaksiyonuna kuyu başına 2,25 μL reaktif çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.</li>
		<li>CuSO4 (1 mM nihai konsantrasyon için 24 mM stoktan 0,75 μL) ekleyin ve çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.</li>
		<li>RT'de karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı 384 kuyu plakalarına bağlanması
	<ol><li>Streptavidin kaplı plakaların kuyularını, 3.2.1 1x adımından 85 μL PBS-T1 ile gece boyunca inkübasyondan sonra yıkayın.</li>
		<li>N-asil-FSL-1-biotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için inkübasyon plakasının her bir kuyucuğundan 3.3.6 adımından streptavidin kaplı plakaya adım 3.4.1'den 11 μL klip-kimya reaksiyonunun 11 μL'sini aktarın.</li>
		<li>64 μL PBS-T1 arabellek ekleyin.</li>
		<li>Streptavidin kaplı kuyucuklara bağlanma kontrolü olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3,1 m'lik bir stoktan 0,19 μM) ekleyin.</li>
		<li>RT'deki 384 kuyu plakasını karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde 300 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.</li>
		<li>Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak plakaları aşağıdaki gibi yıkayın: 85 μL PBS-T2 ile 10 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır; 85 μL PBS ile 5 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan algılama ve analizi
	<ol><li>PBS (85 μL) ekleyin ve floresan mikroplaka okuyucusuna 535 nm'de floresan kaydedin.</li>
		<li>Verileri açıklandığı gibi analiz edin (adım 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Triasillenmiş ürünün floresan tespitine dayanan burada açıklanan Lnt testi protokolü hassas ve tekrarlanabilirdir. Biotin'in streptavidin'e spesifik ve verimli bağlanması, tahlilde kilit bir unsurdur. Lnt reaksiyonunun tamamlanmasından sonra bırakılan alkin-POPE substratı da FAM ile floresan olarak etiketlenir, ancak streptavidin plakalarına çoklu yıkama adımlarıyla bağlandıktan sonra verimli bir şekilde çıkarılır. Ayrıca, DMSO'nun eklenmesi Lnt aktivitesini etkilemez ve tahlil üzerinde hiçbir...

Bakteriyel lipoproteinler, amino terminlerinde kovalent olarak bağlanmış yağ asitleri ile karakterize edilir ve bu asitler 1,2 membranlarına sabitlenir. Proteinin olgun kısmı yapı ve işlev bakımından oldukça çeşitlidir, böylece lipoproteinlerin bakteriyel hücre zarfındaki çeşitli biyolojik süreçlerdeki rolünü açıklar.
Lipoproteinler, sitoplazmik membrana yerleştirildikten sonra fosfolipid kaynaklı yağ asitleri tarafından modifiye edilir. Prolipoproteinler, asillenmiş hale gelen değişmez bir sistein kalıntısı ve olgun proteindeki ilk amino asit içeren bir imza motifi olan lipobox içerir. Bu yolun ilk adımı, diasilgliseril grubunu fosfatidilgliserolden prolipoproteine diyasilgliseril ve sistein arasındaki bir tiyoeter bağlantısı yoluyla prolipoproteine aktaran prolipoprotein fosfatidilgliserol::d iasilgliseril transferaz (Lgt) tarafından katalize edilir. Sinyal peptidaz II (Lsp), sinyal peptidini diasilgliseril prolipoproteinden ayırır ve diasilgliserl moiety yoluyla membrana demirlenen bir apolipoprotein ile sonuçlanır. Üçüncü ve son adım, fosfolipitin sn-1 pozisyonundan apolipoprotein üzerine bir yağ asidi ekleyen ve triasile olgun lipoprotein ile sonuçlanan apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir (Şekil 1)3. Lnt reaksiyonu, kararlı bir tiyoester açil enzim ara ürününün oluştuğu iki aşamalı bir pinpon reaksiyonudur. Lizofosfolipid yan ürünü, reaksiyonun ikinci adımında apolipoprotein substratının asilasyonundan önce salınır.
Fosfolipid substrat özgüllüğü, yüksek oranda Tris-Trisin Üre SDS-PAGE4 üzerinde N-açil diasilgliseril peptidin hareketlilik kaymasına dayanan bir Lnt testinde belirlenir. Küçük polar kafa gruplarına sahip, doymuş [sn-1] ve doymamış [sn-2] fosfolipitler tercih edilen substratlar4'tür. Jel kayma testi, apolipoprotein N-asiltransferazın kapsamlı kinetik çalışmaları veya HTS'nin inhibitör molekülleri tanımlaması için uygun değildir. Alkinli yağ asitlerini kullanan tıklama kimyası, bakteri5'te lipoprotein modifikasyonunu ve ökaryotlarda yağ asidi metabolizmasını incelemek için başarıyla kullanılmıştır6. Son zamanlarda, inhibitörleri7 tanımlamak için Ras palmitoylasyonunun in vitro bir testinin bildirildiği bildirilmiştir.
Burada açıklanan yöntemde, deterjandaki saflaştırılmış aktif Lnt, daha sonra floresan spektrometrisi ile tespit edilen alkin-triasile peptid oluşturmak için karışık misellerdeki substratlarla inkübe edilir.

<table><tbody><tr><td>&amp;Auml;kta Purifier FPLC system</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>alkyne-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Purity: &gt;99%&lt;br/&gt; Lnt substrate</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Purity: 100% (pure)&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td><td>BioTek</td><td>N&amp;deg; serie 115800, n&amp;deg; materiel 405 Select</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Wash steps</td></tr><tr><td>biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Purity: &amp;ge;90%&lt;br/&gt; Fluorescence control</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Purity: &amp;ge;98%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Purity: &amp;ge; 99% &amp;beta;+&amp;alpha;; &amp;lt; 15% &amp;alpha;&lt;br/&gt; Detergent for Lnt purification</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Purity: anhydrous&lt;br/&gt; Solbilization Click reagent</td></tr><tr><td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Handling reagents</td></tr><tr><td>French Pressure Cell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Cell disruption</td></tr><tr><td>FSL-1-biotin</td><td>EMC microcollections</td><td>L7030</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt substrate</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td></tr><tr><td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Purity: ~100%&lt;br/&gt; Thiol specific inhibitor</td></tr><tr><td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Foil to seal multi-well plate</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Lnt purification</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Purity: &amp;ge;13 units/mg protein&lt;br/&gt; Biotin binding</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Purity: 97%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Purity: &amp;ge;98%&lt;br/&gt; Click reagent</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Fluorescence detection</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Heated lid</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Purity: 10% in H2O&lt;br/&gt; Lnt reaction buffer</td></tr><tr><td>Ultra centrifuge</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Purity: NA&lt;br/&gt; Cell fractionation</td></tr></tbody></table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Proteobakterilerden lipoproteinler, üç integral membran enziminin etkisiyle membran fosfolipitlerinden türetilen yağ asitleri tarafından posttranslasyonel olarak modifiye edilir ve triasile proteinlerle sonuçlanır. Lipoprotein modifikasyon yolundaki ilk adım, bir diasilgliseril grubunun fosfatidilgliserolden prolipoproteine transferini içerir ve bu da diasilgliseril prolipoprotein ile sonuçlanır. İkinci adımda, prolipoproteinin sinyal peptidi bölünür ve bir fosfolipitten türetilen üçüncü bir yağ asidi tarafından modifiye edilen bir apolipoprotein oluşturulur. Bu son adım apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir. Lipoprotein modifikasyon yolu, çoğu γ-proteobakteride esastır ve bu da onu yeni antibakteriyel ajanların gelişimi için potansiyel bir hedef haline getirir. Burada açıklanan, küçük inhibitör moleküllerin yüksek verimli taraması ile uyumlu olan Lnt için hassas bir testtir. Enzim ve substratlar membrana gömülü moleküllerdir; bu nedenle, in vitro bir testin geliştirilmesi kolay değildir. Bu, aktif enzimin deterjan varlığında saflaştırılmasını, alkin-fosfolipitlerin ve diasilgliseril peptid substratlarının mevcudiyetini ve karışık misellerdeki reaksiyon koşullarını içerir. Ayrıca, aktivite testini yüksek verimli bir tarama (HTS) kurulumunda kullanmak için, reaksiyon ürününün doğrudan okunması, birleştirilmiş enzimatik reaksiyonlara göre tercih edilir. Bu florometrik enzim testinde, alkin-triasile peptid ürünü, bir tıklama-kimya reaksiyonu yoluyla floresan haline getirilir ve çok kuyulu bir plaka formatında tespit edilir. Bu yöntem, fosfolipitler ve açil-CoA dahil olmak üzere yağ asidi içeren substratlar kullanan diğer asiltransferazlar için geçerlidir.

Lnt reaksiyonunda, fosfolipitlerden gelen sn-1 yağ asidi bir diasilgliseril peptid üzerine aktarılır ve olgun triasile peptid8 ile sonuçlanır. Burada tarif edilen in vitro Lnt testi, substrat olarak bir alkin yağ asidi (alkin-POPE) ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipitleri kullanmak üzere tasarlanmıştır ve bu da alkin-FSL-1-biyotin oluşumuna neden olur. Azido-FAM ile bir tıklama-kimya reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenmeli ve floresan spektrometri ile tesp...

Watch this Scientific Journal Video about Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening at JoVE.com

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

1.9K Görüntüleme.  Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France. Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Video: Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Biyokimya

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Biyomühendislik

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

dNTPase SAMHD1 ile Küçük Molekül Etkileşimini Araştırmak için Yüksek Verimli Enzime Bağlı Aktivite Testi

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

HAT1 Enzim Aktivitesinin Taranması için Tıklama Tabanlı Bir Testin Geliştirilmesi

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Yazar Spotlight: HAT1 İnhibitörü Taraması için Asetil-Tıklama Testi Geliştirme

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

dNTPase SAMHD1 ile Küçük Molekül Etkileşimini Araştırmak için Yüksek Verimli Enzime Bağlı Aktivite Testi

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi