Name: isolation and culture of primary neurons and glia from adult rat urinary bladder
Uploaded: 2020-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 81673676) und dem Dongguan Science and Technology Bureau (Grant-Nr. 2019622101002) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Maryrose Sullivan (Assistant Professor in Surgery, Harvard Medical School) für die technische Beratung.

Alle Versuchsprotokolle und Tierverfahren entsprachen den ethischen Grundsätzen des Nationalen Forschungsrates.
1. Herstellung von Materialien
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Instrumente und ddH2O mit einem Autoklaven, bevor Sie das Experiment durchführen. Zu den Instrumenten gehören u.a. chirurgische Schere, Augenscheren, Zangen, Löffelkernteiler, Glasschalen (60–100 mm Durchmesser) und Glasbrecher.</li>
	<li>Bereiten Sie die Krebs-Lösung wie folgt vor (Tabelle 1): Alle Chemikalien zusammen mit ddH2O vor gebrauchen auflösen. CaCI2 separat auflösen und unter Rühren langsam in die Mischlösung geben, um Sedimente zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Spülmedien vor, die aus F12-Medien mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotika (100x) bestehen. Fügen Sie 5 ml FBS und 0,5 ml Antibiotikum/Antimykotik um 44,5 ml F12-Medien hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie neuronen Medien A, die neurobasale A-Medien mit 2% B-27, 1% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Antimykotik (100x) und 0,1% Glia-abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) umfasst. Fügen Sie 200 l B-27, 100 l FBS, 100 l L L-Glutamin, 100 l Antibiotikum/Antimykotik (100x) und 10 l GDNF (10 g/ml) bis 9,5 ml neurobaales A-Medium hinzu. HINWEIS: Bereiten Sie Neuronenmedien A innerhalb einer Woche nach gebrauch, um die Frische von B-27, L-Glutamin und GDNF zu gewährleisten.</li>
	<li>Bereiten Sie Neuronenmedien B mit dem gleichen Verfahren wie die Vorbereitung von Neuronenmedien A vor, ohne jedoch FBS hinzuzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdauungslösung 1 vor, indem Sie 20 mg Kollagenase Typ II, 6 mg Rinderserumalbumin und 200 l Antibiotikum/Antimykotik (100x) in 10 ml sauerstoffstabiler Krebslösung auflösen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdauungslösung 2 vor, indem Sie 1 ml 0,25% Trypsin mit 4 ml der ausgewogenen Salzlösung von Hank verdünnen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Platte mit beschichteten Abdeckungen.<ol>
<li>Verwenden Sie Zangen in einer laminaren Strömungsbank, wenn Sie Glasabdeckungen in eine 48-Well-Kulturplatte legen.</li>
		<li>Poly-D-Lysin mitddH2O auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml als Poly-D-Lysin-Bestand verdünnen. Lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C und tauen Sie vor Gebrauch.</li>
		<li>Fügen Sie 40 L Poly-D-Lysin-Lager auf jedem Deckelschlupf hinzu und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min. ANMERKUNG: Stellen Sie bei verschiedenen Platten mit unterschiedlichen Basalbereichen die Konzentration auf 4 g/cm2ein. Wenn z.B. die Basalfläche eines Brunnens aus einer 24-Well-Platte 2 cm2beträgt, dann sollten wir 80 l Poly-D-Lysin-Bestand in einen Brunnen übertragen. Jeder cm2 würde 4 g Poly-D-Lysin enthalten.</li>
		<li>Entfernen Sie Poly-D-Lysin in der 48-Well-Platte und spülen Sie Dielipse mit ddH2O dreimal.</li>
		<li>Trocknen Sie die Platte in einer laminaren Durchflusshaube für mindestens 30 min, um sicherzustellen, dass die Platte wasserfrei ist.</li>
		<li>Lagern Sie die Platte bei 4 °C vor der Laminierung höchstens 1 Tag. Die Lagerung der Platte bei 20 °C ist für eine Langzeitlagerung vorzuziehen.</li>
		<li>Laminin bei 4 °C auftauen. Laminin mit ddH2O auf eine Konzentration von 50 g/ml als Lamininvorrat verdünnen. Lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C und tauen Sie vor Gebrauch bei 4 °C auf.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Pipette, um 100 l verdünntes Laminin an die Oberseite jedes Deckellipszuglases zu übertragen und Laminin bei 4 °C für 1 h zu inkubieren. ANMERKUNG: Stellen Sie bei verschiedenen Platten mit unterschiedlichen Basalbereichen die Konzentration auf 5 g/cm2ein. Wenn z. B. die Basalfläche eines Brunnens aus einer 24-Well-Platte 2 cm2beträgt, dann 200 l verdünntes Laminin in einen Brunnen geben. Jede cm2 würde 5 g Laminin enthalten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Lamininlösung und spülen Sie die Abdeckungen einmal mit ddH2O. Führen Sie diesen Vorgang am Rand des Deckslips aus, um Einschübe zu vermeiden. HINWEIS: Beschichtete Abdeckungen können höchstens 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Blasenernte
<ol><li>Erhalten Sie fünf Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten.</li>
	<li>Indercarbogen (95% Sauerstoff, 5%CO2) in die Krebs-Lösung für mindestens 30 min in einem Eisbad, um einen stabilen Sauerstoffzustand und pH-Wert zu erreichen.</li>
	<li>Nach der Euthanasie durch Zervixdislokation die Ratten in 75% Ethanol für 30 s zur Sterilisation einweichen.</li>
	<li>Legen Sie Ratten auf ein sterilisiertes chirurgisches Handtuch und setzen Sie ihren Bauch aus. Öffnen Sie die Bauchhöhle, und offenbaren Sie die Blase mit einer Reihe von Scheren und Zangen.</li>
	<li>Heben Sie die Blase sanft an und schneiden Sie die Blase mit einer weiteren Schere und Zange aus dem Blasenhals, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Legen Sie die Blase schnell in kalte sauerstoffstabile Krebslösung, um das Zellüberleben zu verbessern. HINWEIS: Sobald die Blase entfernt ist, führen Sie die folgenden Operationen schnell durch, um die Aussicht auf neuronen Überleben zu verbessern.</li>
	<li>Fügen Sie Krebs-Lösung in drei Glasschalen und Glasbrecher.</li>
	<li>Bereiten Sie Glasgeschirr und Glasbrecher mit Krebs-Lösung in einem Eisbad zur Vorkühlung vor.</li>
	<li>Markieren Sie diese Behälter mit den Zahlen 1–3 entsprechend, um Verwechslungen zu vermeiden.</li>
	<li>Kombinieren Sie jede Glasschale mit Zangen und einem Löffel Kernteiler.</li>
	<li>In Glasschale 1 die Blase mit einer Augenschere aufschneiden und mit Zangen und einem Löffelkernteiler aufklappen.</li>
	<li>Spülen Sie die Blase in Glasbrecher 1, und legen Sie es in Glasschale 2.</li>
	<li>Beseitigen Sie anhaftendes Fett auf der Gewebeoberfläche mit den Zangen und der Augenschere in Glasschale 2.</li>
	<li>Spülen Sie die Blase in Glasbrecher 2, und legen Sie es in Glasschale 3.</li>
	<li>Kratzen Sie die Blase vorsichtig mit den Zangen und dem Löffelkernteiler auf Glasschale 3, um exogene Anhänge zu entfernen.</li>
	<li>Spülen Sie die Blase im Glasbrecher 3, übertragen Sie die Blase in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 14 ml kalter Krebslösung und drehen Sie die Probe 1 min bei 356 x g und 4 °C.</li>
	<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt zweimal in zwei anderen Rohren mit Krebs-Lösung, um die Kontamination zu reduzieren.</li>
</ol>3. Zweistufige Blasenverdauung
<ol><li>Die Blase aus dem Zentrifugenrohr in eine 2 ml Durchstechflasche mit 1 ml Verdauungslösung 1 übertragen. Verwenden Sie eine Augenschere, um die Blase in kleine Stücke (kleiner als 1 mm) in Lösung zu schneiden.</li>
	<li>Mischen Sie die Blasenlösung mit 9 ml Verdauungslösung 1 in einer sterilen Zellkulturschale (100 mm Durchmesser). Schritt 1 Verdauung in einem Schüttelinkubator für 1 h unter 5%CO2,37 °C und 200 U/min durchführen.</li>
	<li>Nach Schritt 1 Vergärung zentrieren Sie die Lösung bei 356 x g bei 4 °C für 8 min.</li>
	<li>Die Verdauungslösung 2 zur Vorwärmung in ein 37 °C-Wasserbad geben.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, der die Verdauungslösung 1 enthält, und ernten Sie das Zellsediment. Etwas Restflüssigkeit ist erlaubt. Vollständige Entfernung der Lösung kann Zellverlust fördern.</li>
	<li>Zellsediment mit warmer Verdauungslösung 2 in einem 15 ml Zentrifugenrohr mischen und die Mischung schütteln, während sie in einem 37 °C-Wasserbad für 5 min verdauen. Nicht mehr als 7 min Schritt 2 Verdauung oder Neuronen gehen unter.</li>
	<li>Nach der Verdauung Sofort Trypsin in der Mischung mit 10 ml Kaltspülmedium deaktivieren. HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte bei 0 °C–4 °C aus. Ein Eisbad könnte einen solchen Zustand bieten.</li>
	<li>Das Zellsediment nach Zentrifugation bei 356 x g bei 4 °C für 8 min ernten. Entfernen Sie so viele Medien wie möglich, da das verbleibende Trypsin schädlich für das Zellwachstum ist.</li>
	<li>Sediment mit 3 ml Neuronenmedien sanft aufsetzen. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen nicht in der Lösung erzeugt werden, die Zellen für eine hohe Überlebensrate enthält.</li>
	<li>Filtern Sie das Mischungsmedium durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml Zentrifugenrohr.</li>
	<li>Halten Sie das Filtrat bei 30 Umdrehungen pro Minute in einem Eisbad 30 min auf einem Shaker. Dieser Schritt ist nicht notwendig, wird aber empfohlen.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 356 x g bei 4 °C für 8 min, und setzen Sie die Zellpellets in 1 ml Neuronenmedium A sanft wieder auf.</li>
	<li>Fügen Sie 500 l Zellmischung in jeden Brunnen der vorbereiteten 48-Well-Platte.</li>
	<li>Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.</li>
	<li>Ersetzen Sie alle Medien durch Neuronenmedien B in 1 h, um eine serumfreie Kultur bereitzustellen.</li>
	<li>Ändern Sie alle 3 Tage die Hälfte der Neuronenmedien B. HINWEIS: Neuronen sind bereit für immunzytochemische Experimente nach 5–7 Tagen Kultur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. 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Die Autoren erklären keinen größeren Interessenkonflikt.

Plattenvorbereitung Die Verwendung von Glasabdeckungen in 6-, 12- oder 48-Well-Kulturplatten für immunfluoreszierende oder Kalzium-Bildgebungsexperimente ist eine wirtschaftliche und probenschonende Operation. Zellen wachsen gut in Platten ohne Decklippen während der Herstellung von primären Zellkulturen. Daher sind Coverlips in Experimenten wie Western Blot oder Polymerase-Kettenreaktion entbehrlich. Darüber hinaus ist die Beschichtung ein notwendiger Schritt vor der Beschichtung von Zellen, mit ...

Der untere Harnweg hat zwei Hauptfunktionen: periodische Urinlagerung und Micturition1. Die unteren Harnwege Nervensystem (LUTNS) steuert diese Funktionen und ist empfindlich und anfällig für viele Neuropathien, die angeboren sein können (Porphyrie), erworben (Lyme-Krankheit), sekundär zu Krankheitszuständen (diabetische Zystopathie), medikamentös induziert (hämorrhagische Zystitis), Chirurgie verursacht (abdominoperinealresektion), oder Verletzungen verursacht (traumatische Rückenmarksverletzung)2,3,4,5,6. In physiologisch-pathologischen Studien sind In-vivo- und In-vitro-Experimente gleichermaßen wichtig. Während in vivo Forschung auf LUTNS wurde auf Organ-, zelluläre, und molekulare Ebene für einige Zeit durchgeführt, In-vitro-Forschung an primären Neuronen aus der Harnblase ist fast nicht existent8,9. Obwohl die vorliegende Studie begrenzt ist, hoffen wir, die Forschung in diesem Bereich voranzutragen, damit andere Forscher sie verbessern können. Auf diese Weise, Diese Co-Kultur kann zu einem zellulären Verständnis der physiologischen Dysfunktion in Phänotypen führen, wie Blase Neuron Dysfunktion.
Im Gegensatz zu enterischen Muskeln mit einer klaren Richtung der Muskelzellen in diskrete Schichten sind die Muskeln der Blase unorganisiert10. Anstatt die äußere Schicht der Blase abzuschälen, schlägt diese Methode daher vor, die gesamte Blase zu verdauen, um die Schwierigkeit des Betriebs zu reduzieren und die Vorverarbeitungszeit für eine hohe Zellüberlebensrate zu verkürzen.
Nach dieser Methode können wir eine gemischte Kultur von Neuronen und anderen Zellen erhalten. Die anderen Zellen sind unentbehrlich, da ihre Anwesenheit eine in vivo Umgebung imitiert11. Darüber hinaus liefern solche Zellen die Substanzen, die im Medium nicht verfügbar sind.
Diese Methode umfasst zwei Schritte für die Verdauung. Zunächst wird Kollagenase Typ II verwendet, um Kollagen zu hydrolysieren, gefolgt von Trypsin, um das Gewebe in Zellen10zu dissoziieren. Auf diese Weise werden Blasengewebe in einzelne Zellen dispergiert und wachsen dann relativ unabhängig. Wenn die Kultur der Neuronen reift, können die Neuronen für bildgebende oder funktionelle Assays verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Gibico</td><td>15050065</td><td>Enzyme digestion</td></tr><tr><td>48-well culture plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Coating dish</td></tr><tr><td>antibiotic/antimycotic</td><td>Gibico</td><td>15240062</td><td>Culture media/Rinse media</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>ICC</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibico</td><td>17504044</td><td>Culture media</td></tr><tr><td>BSA Fraction V</td><td>Gibico</td><td>332</td><td>Enzyme digestion</td></tr><tr><td>Choline Acetyltransferase Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab18736</td><td>ICC</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Heraeus</td><td>B16UU</td><td>Cells culture</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Sigma</td><td>2593923</td><td>Enzyme digestion</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibico</td><td>11330032</td><td>Rinse media</td></tr><tr><td>DYNLL2 Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13969</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibico</td><td>10100147</td><td>Culture media/Rinse media</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Jin Zhong Medical Devices</td><td>1383</td><td>10 cm; Sterile operation</td></tr><tr><td>Glass breakers</td><td>Huan Qiu Medical Devices</td><td>1101</td><td>50 ml; Sterile operation</td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>WHB Scientific</td><td>WHB-48-CS</td><td>Coating dish</td></tr><tr><td>Glass dishes</td><td>Huan Qiu Medical Devices</td><td>1177</td><td>100 mm; Sterile operation</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488</td><td>Southernbiotech</td><td>3050-30</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555</td><td>Southernbiotech</td><td>3050-30</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>BD</td><td>561908</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Laminar flow bench</td><td>Su Jie Medical Devices</td><td>CB 1400V</td><td>Sterile operation</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Coating dish</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td>Culture media</td></tr><tr><td>MAP-2 Antibody</td><td>Affinity</td><td>AF5156</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Murine GDNF</td><td>Peprotech</td><td>AF45044</td><td>Culture media</td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Gibico</td><td>10888022</td><td>Culture media</td></tr><tr><td>Ophthalmic scissors</td><td>Shanghai Jin Zhong Medical Devices</td><td>J21010</td><td>12.5 cm; Sterile operation</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>3120000240</td><td>100-1000 ul; Reagent and sample pipetting</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td>10-100 ul; Reagent and sample pipetting</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td>Coating dish</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Ping Fan Instrument</td><td>TGL-16A</td><td>Enzyme digestion</td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments</td><td>T8-1</td><td>Enzyme digestion</td></tr><tr><td>SLC17A9 Antibody</td><td>MBL International</td><td>BMP079</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Spoons nucleus divider</td><td>Shanghai Jin Zhong Medical Devices</td><td>YZR030</td><td>12 cm; Sterile operation</td></tr><tr><td>Substance P Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-58591</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Shanghai Jin Zhong Medical Devices</td><td>J21130</td><td>16 cm; Sterile operation</td></tr><tr><td>Surgical towel</td><td>Fu Kang Medical Devices</td><td>5002</td><td>40 x 50 cm; Sterile operation</td></tr><tr><td>Synapsin-1 Antibody</td><td>CST</td><td>5297T</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Tubulin beta Antibody(&amp;beta;-III-tubulin)</td><td>Affinity</td><td>AF7011</td><td>ICC</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary neurons and glia from adult rat urinary bladder

Die unteren Harnwege hat zwei Hauptfunktionen, nämlich regelmäßige Urinlagerung und Micturition; diese Funktionen werden durch zentrale und periphere Neuroregulation vermittelt. Obwohl umfangreiche Forschung über die unteren Harnwege Nervensystem durchgeführt wurde, die meisten Studien haben sich auf primärkultur konzentriert. Dieses Protokoll führt eine Methode zur Isolierung und Kultur von Blasenneuronen und Glia von Sprague-Dawley Ratten ein. Bei dieser Methode wurden die Neuronen und Glia in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 5–7 Tage inkubiert. Infolgedessen wuchsen sie zu ausgereiften Formen heran, die für verwandte nachfolgende Immunfluoreszenzexperimente geeignet waren. Die Zellen wurden mit einem optischen Mikroskop morphologisch beobachtet. Neuronen, synaptische Vesikel und Glia wurden durch β-III-Tubulin und MAP-2, Synapsin-1 bzw. GFAP-Färbung identifiziert. In der Zwischenzeit wurde die Immunzytochemie an mehreren Neurotransmitter-bezogenen Proteinen durchgeführt, wie Cholin-Acetyltransferase, DYNLL2 und SLC17A9.

Im Prozess der primären Zellkultur waren die erfassten Zellen rund mit hellen und klaren Grenzen vor dem angefügten Zustand. Als die Neuronen wuchsen, begannen Dendriten und Axone zu unterscheiden. Nach 5–7 Tagen Kultur erreichten die Neuronen eine reife Form mit langen Projektionen, die ideal für Bildgebungs- oder Funktionsstudien waren. Obwohl die meisten Verunreinigungen und Zellablagerungen aufgrund wechselnder Medien entfernt werden konnten, waren bestimmte Residuen, die an Poly-D-Lysin- und Lamininbeschichtung...

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Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

Dieses Protokoll versucht, ein wiederholbares Protokoll für primäre Neuronen und Gliaisolation von Rattenblase für weitere zelluläre Experimente zu etablieren.

Isolation und Kultur der primär neuronen und Glia von Adult Ratte Harnblase

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

isolation-culture-primary-neurons-glia-from-adult-rat-urinary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Aufrufe.  Guangzhou University of Chinese Medicine. Dieses Protokoll versucht, ein wiederholbares Protokoll für primäre Neuronen und Gliaisolation von Rattenblase für weitere zelluläre Experimente zu etablieren.

Serie: Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Immunologie und Infektion

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from a Rat Urinary Bladder

Source: Wang, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61177">Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a technique for generating a primary culture of neurons and glia from a rat&#39;s urinary bladder. It outlines the steps involved in tissue preparation, enzymatic digestion to obtain single cells, and culturing the cells in a neuron-specific medium to establish a primary neuronal and glial culture.

Isolierung und Kultur von primären Neuronen und Gliazellen aus einer Harnblase von Ratten

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolation of Neural Stem Progenitor Cells from the Spinal Cord Periventricular Region of an Adult Rat

Source: Mothe, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/52732">Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video presents a method for isolating neural stem/progenitor cells from the periventricular tissue of the spinal cord in adult rats. The technique includes incubating the tissue fragments in a solution containing proteolytic enzymes to disrupt the extracellular matrix and release the cells. Subsequently, the released cells are plated in a medium containing specific growth factors that enhance neural stem/progenitor proliferation and promote aggregation into three-dimensional neurospheres.

Isolierung von neuralen Stammvorläuferzellen aus der periventrikulären Region des Rückenmarks einer erwachsenen Ratte

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Preparation of Dissection ...