Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zu identifizieren, die zur Identifizierung neuartiger Gene verwendet werden kann, die an der Calciumsignalisierung beteiligt sind. Dazu verwenden wir den klassischen vorwärts genetischen Bildschirm. Calciumsignalisierung ist ein wichtiger Abwehrweg in mehreren Anlagensystemen.
Um die Gene zu identifizieren, die an diesem Pfad beteiligt sind, haben wir den klassischen vorwärtsgenetischen Bildschirm verwendet. Bei dieser Methode würde EMS als Alkylierungsmittel verwendet werden, um zufällige Mutationen in den Pflanzensystemen einzuführen. Die entwickelte Mutantengeneration kann dann zum Screening auf einen Phänotyp von Interesse verwendet werden.
Sobald der Phänotyp von Interesse identifiziert wurde, kann das kausale Gen kartiert werden. In dieser Studie verwenden wir die Modellpflanze Arabidopsis, die den Kalziumreporter Aequorin im Spektrum hat. Wiegen Sie 150 mg Samen von Aequorin für EMS-Mutagenese und weitere 150 mg Samen zur Kontrolle.
Die Samen in eine 50 ml Falcon-Röhre geben und 2%EMS oder autoklaviertes Wasser hinzufügen. Seien Sie bei der Verwendung von EMS vorsichtig, da es krebserregend ist. Schutzausrüstungen sollten während der Verwendung von EMS getragen werden und jede Art von Verschüttung sollte verhindert werden.
Versiegeln Sie die Falcon-Rohre mit Paraffin und wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie. Drehen Sie das Rohrende bei Raumtemperatur 18 Stunden lang über das Ende. Lassen Sie die Samen die EMS-Lösung sorgfältig absetzen und entfernen und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter, der einen Mol NaOH enthält.
Waschen Sie die mutagenisierten Samen mindestens achtmal mit 40 ml autoklaviertem Wasser. Für die Endwäsche 100 Millimolar Natriumthiosulfat hinzufügen und mindestens dreimal ausspülen, um Emsspuren zu entfernen. Die Samen in 40 ml autoklaviertem Wasser für eine Stunde einweichen, um EMS aus den Samen zu diffundieren und dann auf Whatman-Papier zu legen, bis es vollständig trocken ist.
Die Samen nach Eppendorf geben und bei vier Grad Celsius für zwei bis vier Tage zur Schichtung brüten. Übertragen Sie sowohl die mutagenisierten Samen als auch die mit Wasser behandelten Samen auf den Boden und übertragen Sie sie in Wachstumsräume mit 16-stündigem Licht und achtstündiger dunkler Fotoperiode bei 22 Grad Celsius und 70 % relativer Luftfeuchtigkeit. Um festzustellen, ob die Mutagenese erfolgreich war, suchen Sie nach Chlorophyll-Sektor.
Wir haben die einzige Stammbaum-basierte Saatgut-Sammlungsmethode verwendet und jede M1-Pflanze erhält eine eindeutige Nummer. Nach der Reifung werden die Samen aus diesen einzelnen mutierten Pflanzen geerntet und als einzelne M1-Linien gelagert. Es wird ein Hochdurchsatz-Samensterilisations- und hydroponisches Pflanzenwurzelprotokoll verwendet, das von Ranf et al.
Am ersten Tag legen Sie fast 12 bis 15 M2 Samen pro M1 eine Linie in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte und sterilisieren mit Natriumhypochlorit und Salzsäurelösung im Verhältnis drei ist zu eins. Dadurch wird Chlorgas freigegeben, das die Samen sterilisiert. Lassen Sie die Platte für die Nacht, um das verbleibende Chlorgas vollständig zu verdampfen.
Nach der Sterilisation halbfeste flüssige MS-Medien in einzelne Brunnen geben und die Samen zwei bis vier Tage bei vier Grad Celsius schichten und die Samen dann in eine Wachstumskammer mit einer Fotoperiode von 10 Stunden Licht und 14 Stunden Dunkelheit bei 22 Grad Celsius, 70% relative Luftfeuchtigkeit bewegen. Am 14. Tag, wenn die Sämlinge acht bis zwölf Tage alt sind, legen Sie 12 M2 Sämlinge aus jeder Linie einzeln in eine 96-Well-Leuchtkraftplatte. Nach dem Sämlingstransfer 150 Mikroliter der fünf mikromollaren Coelenterazin-Lösung in einzelnen Brunnen hinzufügen und acht Stunden bei 21 Grad Celsius im Dunkeln lagern.
Coelenterazin ist eine prothetische Gruppe, die an Apoaequorin bindet, um funktionelles Aequorin zu bilden. Coelenterazin ist lichtempfindlich und wird daher in dunkel gefärbten, lichtgeschützten Flaschen gelagert. Am nächsten Tag werden Siebmutanten mit Wasserstoffperoxid als Stimulus verwendet und die anschließende Kalziumhöhe gemessen.
Für die gleichzeitige Messung von 24 Bohrwerten wird ein automatisiertes kinetisches Programm erstellt, das eine Minute lang den Hintergrund misst, gefolgt von Stimulusaddition und Messung für 10 Minuten, gefolgt von einer Entladungsinjektion 150 Mikroliter und einer Messung für drei bis fünf Minuten. Und jede Entladung für die Tochter Aequorin würde in den Messwert einbezogen werden, um das gemessene Kalzium zu quantifizieren und als zusätzliche Kontrolle für funktionelles Aequorin. Die von der obigen Methode bereitgestellten Messwerte sind in relativen Lichteinheiten angegeben.
Für die Berechnung der zytosolischen Calciumionenkonzentration wird eine zuvor beschriebene Konzentrationsgleichung von Rental und Knight aus dem Jahr 2004 verwendet, die im Protokoll beschrieben wird. Die aus dem Luminometer gewonnenen RLUs werden der Gleichung zur Berechnung der Calciumionenkonzentration hinzugefügt. Die erhaltenen zytosolischen Calciumionenwerte werden dann grafisch gegen eine Wildtypkontrolle zur Identifizierung vermeintlicher Wasserstoffperoxid-Mutationen zur Kalziumreaktion dargestellt.
Dies ist ein repräsentatives Ergebnis des gezeigten Protokolls. Wir haben eine M1-Linie mit 12 einzelnen Sämlingen gezeigt, die auf die Erhöhung der Calciumionenkonzentration gemessen wurden. Die grüne Linie im Diagramm zeigt Wildtyp-Aequorin an, das zusammen mit Mutanten gemessen wurde.
Rot ist der Durchschnitt aller 12 Sämlinge, und schwarze Linie ist einzelne M2 Sämlinge für die Calciumionenhöhe gemessen. Saatgut, das eine stark reduzierte Reaktion auf die Wasserstoffperoxidanwendung zeigt, wird dann gerettet. Gerettete Mutanten werden dann in der nächsten Generation bestätigt, gefolgt von kartierung, um kausale Gene zu identifizieren.
Vorsicht ist geboten, wenn EMS als Mutagen verwendet wird, da es ein karzinogenes ist. Die Schutzausrüstung sollte jederzeit getragen werden, und jede Verschüttung sollte mit guten Laborpraktiken behandelt werden. Darüber hinaus sollten bei einer Stammbaum-basierten Samensammlung einzelne Pflanzen mit größter Sorgfalt geerntet werden, damit es zu keinem Zeitpunkt eine Vermischung von Samen gibt.
Dies wird einem helfen, zurückzugehen und die Mutterpflanze zu verfolgen, die die homozygote mutierte Pflanze ist. Da diese Methode keine Verzerrungen oder vorausgegangene Annahmen in die Screening-Methode einführt, kann sie für eine oder mehrere Bedingungen verwendet werden, um einen Phänotyp von Interesse zu identifizieren. Darüber hinaus konnten mehrere unabhängige Gene mit demselben Protokoll identifiziert werden.
Das Protokoll ist einfach zu bedienen, da mit der kleinen Dosierung eine große Anzahl von Pflanzen mutagenisiert werden kann. Diese große Anzahl von mutierten Pflanzen kann für mehrere Populationen und für mehrere Bedingungen verwendet werden und mehrere Gene zu identifizieren. Durch diese Methode kann ein partieller Funktionsverlust, eine veränderte Funktion, ein vollständiger Funktionsverlust oder auch eine konstitutive Genfunktion identifiziert werden.
Die Zuordnung sollte angesichts der Weiterentwicklung der Mapping-Technologien in den aktuellen Szenarien eine einfache Aufgabe sein. Ein de novo-basiertes Kartierungssystem, ein SNP-basiertes rassisches Plotten und viele andere können verwendet werden, um das kausale Gen zu identifizieren, das den Phänotyp von Interesse verursacht. Angesichts der Anwendbarkeit dieser Methode kann sie nicht nur auf den Arabidopsis-Modellpflanzen verwendet werden, sondern auch auf anderen Modellpflanzen, sofern ein Phänotyp der Interessenanzeige festgestellt werden kann.
