Unsere Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Rolle des Nervensystems bei der Progression der Atherosklerose. Konkret geht es bei jeder Interaktion mit dem Kieferkamm um Antworten darauf, wie sich der Nerv während der Atherosklerose verändert und wie seine Interaktion das Fortschreiten der Erkrankung beeinflusst. Mehrere Spitzentechnologien werden derzeit eingesetzt, um die Atheroskleroseforschung voranzutreiben und so das Verständnis der Krankheitsmechanismen zu verbessern.
Dazu gehören Gewebereinigung und 3D-Bildgebung, fortschrittliche mikroskopische Techniken, künstliche Intelligenz, Einzelzellsequenzierung und maschinelles Lernen. Während des Fortschreitens der Atherosklerose werden arterielle Wandkomponenten einer robusten Umstrukturierung unterzogen. Die Darstellung der Veränderungen in 3D und die hochauflösende Bildgebung des intakten Gewebes sind die wichtigsten experimentellen Herausforderungen.
Die hier beschriebenen bildgebenden Verfahren werden Forschern und Kardiologen helfen, die Krankheit besser zu verstehen und schließlich bei der Behandlung von Patienten zu helfen. Das hier beschriebene Protokoll bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, wie z. B. der tiefen Gewebebildgebung des intakten Gewebes sowie der Visualisierung ihrer Struktur, die sonst nicht zugänglich sind. Diese Protokolle werden dazu beitragen, die Interaktion zwischen Zelle und Zelle und Gewebe besser zu verstehen, um das Verständnis des Krankheitsverlaufs zu verbessern.
Die Visualisierung der zellulären und strukturellen Veränderungen in 3D im intakten Gewebe kann neue Erkenntnisse liefern, um die unbeantworteten biologischen Fragen in der kardiovaskulären Forschung besser zu verstehen. Legen Sie die betäubte Maus zunächst auf eine Schaumstoffplatte, die mit chirurgischen Papiertüchern bedeckt ist. Fixieren Sie die Arme und Beine der Maus mit Klebebändern in Rückenlage.
Desinfizieren Sie die Brust mit 75% Ethanol. Entnehmen Sie das Blut aus dem linken Ventrikel mit einer Ein-Milliliter-Einwegspritze. Machen Sie dann einen Schnitt in der Mittellinie an der Brust und einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof.
Perfundieren Sie den linken Ventrikel der Maus fünf Minuten lang mit 10 Millilitern fünf Millimolar EDTA in PBS, bis das Blut ausgespült ist, gefolgt von 20 Millilitern PBS für 5 bis 10 Minuten. Zum Schluss 20 Minuten lang mit 10 Millilitern 4%-Paraformaldehyd durchbluten. Entfernen Sie unter einem Präparier-Stereomikroskop die inneren Organe, einschließlich der Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane.
Lassen Sie das Herz, die Aorta und die Nieren intakt. Anschließend werden der Thymus und das umliegende Fettgewebe vorsichtig entfernt. Legen Sie die gesamte Aorta von der aufsteigenden Aorta bis zur Beckenbifurkation frei.
Entnehmen Sie die gesamte Aorta und geben Sie sie in eine mit PBS gefüllte Petrischale. Teilen Sie die Aorta in verschiedene Segmente und teilen Sie sie in Längsrichtung für zwei 2-, 2'Thiodiethanol- oder TDE-Clearings. Stecken Sie die Aorta der Stirnfläche auf eine flache schwarze Wachsplatte in Y-Form und fixieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in 4%-Paraformaldehyd.
Lösen Sie am nächsten Tag die Aorta und geben Sie sie für eine fünfminütige Wäsche in PBS. Übertragen Sie dann die Aorta für zwei Stunden in eine Blockierungslösung, um sie zu blockieren und zu permeabilisieren. Inkubieren Sie anschließend die Aorta 24 Stunden lang mit Primärantikörpern in der Blockierungslösung.
Waschen Sie die Aorta fünf Minuten lang in PBS, wiederholen Sie dies fünfmal, bevor Sie sie mit Sekundärantikörpern in 10% normalem Eselsserum und DAPI für die Kernfärbung über Nacht inkubieren. Übertragen Sie die gefärbte Aorta in eine zunehmende Konzentration der TDE-Lösung. Kleben Sie als Nächstes den doppelseitigen, klebrigen rechteckigen Abstandshalter gut auf einen sauberen Objektträger und übertragen Sie die freigewordene Aorta, wobei Sie sicherstellen, dass die Aortenadventitia auf der Endfläche dem Deckglas zugewandt ist. Montieren Sie die Aorta mit Tropfen 60%iger TDE-Lösung und befestigen Sie vorsichtig einen Deckglas an der Vertiefung, um Luftblasen zu vermeiden.
Schalten Sie das inverse konfokale Laser-Scanning-Mikroskop ein, das mit einem 20-fach-Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Stimmen Sie die Hybrid-Diodendetektoren auf Basis der Fleckenfarbstoffe ab. Passen Sie die Anzeigeeinstellungen an und wählen Sie das XY-Format mit 1024 x 1024 Pixeln für die Bildgebung aus.
Tropfen Sie Immersionsöl auf den Deckglas und bewegen Sie das 63x-Objektiv grob in Richtung der Probe, bis es das Immersionsöl und den Deckglas berührt. Identifizieren Sie dann den interessierenden Bereich und erfassen Sie Z-Stapel von der Adventitia-Seite der Aorta der Stirnfläche in Schritten von zwei bis vier Mikrometern bis zu einer Tiefe von 60 Mikrometern für die dreidimensionale Bildgebung. Benennen Sie die Datei mit Beispieldetails und Scandetails, und speichern Sie die Daten.
Mit einem aufrechten Multiphotonenmikroskop, das mit einem 20-fach-Objektiv ausgestattet ist, können Z-Stapel von der abluminalen Seite in Schritten von 10 bis 15 Mikrometern bis zu einer Tiefe von 700 Mikrometern erfasst werden. Nachdem Sie die Maus betäubt und mit PBS und Paraformaldehyd durchblutet haben, präparieren Sie den Körperteil oberhalb des Zwerchfellniveaus. Fixieren Sie den unteren Körperteil ein bis zwei Tage lang bei vier Grad Celsius mit 4%Paraformaldehyd.
Waschen Sie die Probe anschließend 10 Minuten lang gründlich in PBS und wiederholen Sie dies dreimal. Inkubieren Sie die Probe 48 Stunden lang in einer 20%igen kubischen Lösung. Nach dem Waschen mit PBS inkubieren Sie die Probe über Nacht in PGST-Lösung, um sie zu permeabilisieren und zu blockieren.
Am nächsten Tag inkubieren Sie die Probe mit Primärantikörpern in PGST-Lösung bei vier Grad Celsius und leichtem Schütteln für 10 bis 12 Tage. Nach dem Waschen der Probe in PGST fügen Sie sieben Tage lang Sekundärantikörper in DAPI in PGST bei vier Grad Celsius hinzu. Waschen Sie die Probe eine Stunde lang gründlich in PGST und wiederholen Sie sie fünfmal.
Die gefärbte Probe wird einer Reihe von erhöhten Konzentrationen von Tetrahydrofuran-Arbeitslösungen zur Dehydratisierung zugeführt und 12 Stunden pro Konzentration inkubiert. Legen Sie die Probe nach der Dehydrierung drei Stunden lang in eine absolute Dichlormethanlösung, um sie zu lipidentfernen. Inkubieren Sie die Probe anschließend drei bis sechs Stunden lang in einer Brechungsindex-passenden Benzylalkohol-Benzylbenzoatlösung.
Laden Sie zunächst die Z-Stapel-gekachelten Bilder der Maus-Aorta und der Bilder der unteren Körperteile auf die Bildverarbeitungs-Workstation. Um die Volumentiefe einer Zelle oder Struktur farblich zu kodieren, verwenden Sie eine Bildwiederherstellungssoftware, um das Rohbild zu dekonvolutieren. Generieren Sie in der Fiji-Software eine Projektion mit maximaler Intensität der entfalteten Daten mithilfe der zeitlichen Farbcodierung.
Laden Sie die TIFF-Bildserie mit Z-Stapel-Kacheln in die Software. Fügen Sie mit dem Fiji Stitching-Plugin die Bilder zusammen und speichern Sie sie im TIFF-Format. Laden Sie als Nächstes die zusammengefügten Bilder in eine dreidimensionale Visualisierungssoftware für die Bildsegmentierung.
Verfolgen Sie manuell die neuronalen Strukturen in der X-Y-Z-Achse entlang des gesamten Weges zwischen Aorta und Ganglien. Laden Sie vorverarbeitete Bilder in eine Bildanalysesoftware. Verwenden Sie Autofluoreszenz, um die Aorta und das Bindegewebe zu segmentieren.
Tragen Sie separate Pseudofarben auf, um die ausgeprägte Aortenwand und die Plaque zu visualisieren. Verwenden Sie abschließend die kontrastbegrenzte adaptive Histogramm-Entzerrungsfunktion, um den lokalen Kontrast über dem Hintergrund der verarbeiteten Bilder zu verbessern. Die TDE-geklärte atherosklerotische Aorta zeigte CD3e-gefärbte T-Zellen in Plaques, einer ausgedehnten Neogenese von NF200-gefärbten Nervenfasern in arteriellen tertiären lymphatischen Organen.
Multiphotonen-Bildgebung der erkrankten Bauchaorta in APOE-Knockout-Mäusen zeigte, dass NF200-exprimierende Axone in Regionen ohne B220-positive B-Zellen in tertiären lymphatischen Organen der Arterie sprießen. Die Lichtblattbildgebung des iDISCO-geklärten Mausabdomens visualisierte die räumliche Beziehung zwischen der Aorta und den sympathischen Ganglien mit neu gebildeten NF200-gefärbten Axonen auf den Adventitien neben der atherosklerotischen Plaque.
