Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Medikamentenabgabe zu beantworten, wie die gezielte Abgabe von Therapeutika auf menschliche Krebsarten und die Plazenta Cystoblast. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine einfache und reproduzierbare Methode ist, Peptide zu synthetisieren, die in anderen Partikeln konjugiert sind. Zunächst drei Millimeter ethanolvon vier Prozent zu einem sterilen 10-Milliliter-Zentrifugenrohr hinzufügen.
Fügen Sie dann 90 Mikrogramm Soja-Lecithin-Lagerlösung, 210 Mikrogramm DSPE-PEG-Carbonsäure-Lagerlösung und 750 Mikrogramm DOX-Lagerlösung hinzu. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um zwei Milligramm PLGA-Lagerlösung zu pipette. Das Zentrifugenrohr in ein Eisbad auf einen Ultraschallprozessor legen und zwei Minuten beschallen.
Fügen Sie dann die PLGA-Lagerlösung tropfenweise in das Zentrifugenrohr ein. Um die DNPs zu reinigen, verwenden Sie einen Zentrifugenfilter, um die Lösung in 0,1 molem MES-Puffer zu waschen. Dann zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.
Um die Esteraktivierung zu beginnen, fügen Sie 0,4 Milligramm EDC zu einem Milliliter DNPs hinzu. Dann fügen Sie 0,24 Milligramm NHS zur Reaktion hinzu. Dann lassen Sie die Reaktion für bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln auftreten.
Danach die Reaktionskomponenten gründlich mischen und die Reaktion auf einen Shaker legen. Um die Aminreaktion zu starten, verwenden Sie PBS, um den Puffer-pH-Wert von 7,2 auf 7,5 zu erhöhen. Dann fügen Sie 0,5 Milligramm pICSA Targeting Peptid auf die Reaktionslösung.
Mischen Sie die Lösung gut und legen Sie sie auf einen Shaker. Dann lassen Sie die Reaktion bei vier Grad Celsius über Nacht im Dunkeln ablaufen. Füllen Sie am nächsten Tag Dialysebeutel mit der Konjugatlösung.
Reinigen Sie die pICSA DNPs mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur für 24 Stunden im Dunkeln. Nach der Kultivierung von Zellen gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie die Medien und fügen Sie einen Milliliter frischer, kalter Medien mit fünf Prozent FBS und pICSA DNPs oder DNPs hinzu. Dann inkubieren Sie die Zelle und Nano-Partikel-Mischung für eine Stunde bei vier Grad Celsius.
Danach entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Dann fügen Sie einen Milliliter frische Medien hinzu und brüten die Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Danach entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
Dann fügen Sie zwei Milliliter Kälte, vier Prozent PFA und inkubieren sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie die PFA und waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter PBS mit DAPI für die Kernfärbung hinzu.
Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten brüten. Fügen Sie schließlich das Montagemedium hinzu und stellen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Mit diesem Protokoll wurden DNPs erfolgreich vorbereitet und mit pICSA BP konjugiert. Nach der Konjugation erhöhte sich der Durchmesser der primären DNPs auf etwa 109 Nanometer.
Die TEM-Bilder der DNPs und der pICSA DNPs zeigten, dass die Teilchen gut dispergiert waren und im Allgemeinen sphärische Morphologie zeigten. Das Zeta-Potenzial der Nanopartikel betrug negative 20,1 und 29,9 Millivolt, was darauf hindeutet, dass die Nanopartikel sehr stabil waren. Der JEG3-Zellaufnahmetest zeigte die pICSA DNPs an, die innerhalb von 30 Minuten an die JEG3-Zellen gebunden sind.
Daher wurde der pICSA BP effizient an die Oberfläche konjugiert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Mischung ein bis zwei Minuten lang zu beschallen, bevor Sie PLGA hinzufügen. Nach diesem Verfahren können unsere Methoden wie HPLC-Assay durchgeführt werden, um die Konjugationseffizienz genauer zu bestimmen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie, um die Möglichkeit einer Plazenta-Targeting-Behandlung bei Schwangerschaftskomplikationen zu erforschen.
