So kann die DNA-Methylierungs-Genom-weite Analyse mit der LA-Plattform für komplexe Aberration der DNA-Methylierung im menschlichen Genom wichtige Informationen über epigenetische Biomarker bei Magen-Darm-Krebs liefern. Obwohl diese LA-Plattform für komplexe Aberration der DNA-Methylierung im menschlichen Genom, ist es optimal in Bezug auf Kosten und genomische Abdeckung. Das Verfahren wird hirotaka Momose demonstrieren, ein Student aus meinem Labor.
Bereiten Sie zunächst 10 Mikrometer ungefärbter formalinfixierter Paraffin-Eingebettete Abschnitte vor. Legen Sie die Dias in einen Glasschieberhalter und füllen Sie sie mit Einer Linie, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe auf der Folie untergetaucht ist. Lassen Sie die Dias 15 Minuten in Xylol, dann gießen Sie das Xylol aus, während Sie die Dias mit einer Pipettenspitze halten, damit sie nicht herausfallen.
Gießen Sie mehr Xylol auf das gleiche Niveau wie zuvor und wiederholen Sie die Inkubation. Gießen Sie das Xylol aus und füllen Sie den Schiebehalter mit 100% Ethanol, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe auf der Folie vollständig untergetaucht ist. Lassen Sie die Rutschen im Ethanol für drei Minuten, dann ersetzen Sie das Ethanol mit frischem Ethanol und lassen Sie sie für zwei weitere Minuten inkubieren.
Gießen Sie das Ethanol ab und entfernen Sie die Dias. Legen Sie sie vorsichtig nach oben auf ein sauberes Papiertuch und lassen Sie sie für 10 Minuten trocknen. Füllen Sie ein 1,5 Milliliter-Einweg-Polypropylenrohr mit 80 Mikroliter Lysepuffer und legen Sie eine saubere Pipettenspitze in den Puffer.
Identifizieren Sie Krebsgewebe des Tumorbereichs, der am besten für die Makrodissektion geeignet ist, gemäß dem entsprechenden H&E-Gefärbtenabschnitt, und sezieren Sie dann das Krebsgewebe auf der Grundlage des markierten Abschnitts. Nehmen Sie eine saubere Rasierklinge und kratzen Sie das Krebsgewebe vorsichtig von der Rutsche, um es in einem Stück zu halten. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das abgekratzte Gewebe in die Lysepufferdurchstechsons zu übertragen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Folien. Nachdem sich das Gewebe in der Röhre befindet, verwenden Sie die Spitze, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist und nicht an der Wand klebt. Fügen Sie 20 Mikroliter einer subtilisinen-bezogenen Serin-Protease in die Durchstechflasche und flicken Sie sanft zum Mischen.
Legen Sie die Durchstechflasche mindestens vier Stunden oder über Nacht in einen 55 Grad Celsius-Wärmeblock und sorgen Sie dafür, dass sie nach zwei Stunden leicht wirbelt. Führen Sie die Bisulfitbehandlung auf 45 Mikroliter des verdauten Gewebes mit einem Bisulfit-Umwandlungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Fügen Sie der Probe fünf Mikroliter Verdünnungspuffer hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
In der Zwischenzeit bereiten Sie das Bisulfit-Umwandlungsreagenz vor, indem Sie 750 Mikroliter destilliertes Wasser und 210 Mikroliter Verdünnungspuffer zu einem Röhrchen CT-Umwandlungsreagenz hinzufügen. Mischen Sie die Rohre durch Wirbeln für 10 Minuten, dann fügen Sie 100 Mikroliter des vorbereiteten CT-Umwandlungreagenz zu jeder Probe und mischen Sie durch Inversion. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei 50 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden.
Nach der Inkubation die Proben 10 Minuten auf Eis legen. Fügen Sie 400 Mikroliter Bindungspuffer hinzu und mischen Sie jede Probe, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Laden Sie jede Probe in eine Spin-Spalte und legen Sie die Spalte in ein Zwei-Milliliter-Sammelrohr.
Zentrifugieren Sie die Proben mit voller Geschwindigkeit für eine Minute und entsorgen Sie den Durchfluss. Fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer zu jeder Säule hinzu und drehen Sie mit voller Geschwindigkeit für eine Minute, und entsorgen Sie dann den Durchfluss. Fügen Sie 200 Mikroliter Desulphonationspuffer zu jeder Säule hinzu und lassen Sie die Säulen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
Drehen Sie die Spalten nach der Inkubation mit voller Geschwindigkeit für eine Minute und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule zweimal mit 200 Mikroliter Waschpufferzentrifugieren für eine Minute bei voller Geschwindigkeit nach jeder Wäsche. Fügen Sie 46 Mikroliter destilliertes Wasser in jede Säule und legen Sie es in eine neue sterile 1,5 Milliliter Einweg-Polypropylen-Röhre.
Drehen Sie die Rohre für zwei Minuten, um die DNA zu löschen und die Spalte zu entsorgen. Die DNA ist nun für die Analyse bereit. Verwenden Sie die bisulfitmodifizierte DNA als Vorlage für quantitative methylierungsspezifische PCR, um die Methylierung der Promotorregion in jeder Genanalyse zu bewerten.
Kombinieren Sie die Reagenzien, wie im Textmanuskript beschrieben, und verwenden Sie ein 96-Well-Echtzeit-PCR-Instrument, um das Thermo-Zyklus-Protokoll auszuführen. Die Merkmale von 48 Patienten mit Magenkrebs in der Trainingskohorte werden hier gezeigt. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 74 Jahre und die Kohorte umfasste 38 Männer und 10 Frauen.
Zunächst wurden alle 48 Proben zur Identifizierung von Ausreißern geladen. Zwei Proben ergaben Spitzen, die größer als zwei Standardabweichungen waren, die von den anderen verschoben wurden, und diese Proben wurden entfernt. Die resultierende Wärmekarte wurde auf der Grundlage von hoher und niedriger Methylierung in zwei Gruppen eingeteilt.
Diese Heatmap ermöglicht die Visualisierung der Top 50 Sonden innerhalb von 1. 500 Basispaaren des Transkriptionsstartplatzes in der Differentialmethylierungsanalyse. Die Art des Krebses und das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen traten als signifikante unabhängige Vorhersagefaktoren auf, als die klinischen pathologischen Faktoren als Kovariate in der multivariaten Analyse verwendet wurden. Schließlich wurde festgestellt, dass das EPB41L3-Gen in der Mikroarray-Analyse stark mit der Kodifizierung der Trainingskohorte in hohe und niedrige Methylierungsgruppen in Verbindung gebracht wird.
Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse für EPB41L3 in der Testkohorte wurden mit quantitativer methylierungsspezifischer PCR validiert. RMVs von EPB41L3 in PGC-Geweben waren in der univariaten Analyse signifikant höher als bei Magenkrebs. In ähnlicher Weise waren RMVs in Proben mit Lymphknotenmetastasen signifikant höher als rmVs ohne Lymphknotenmetastasierung.
Daher ist eine Identifizierung auf Krebsgewebe erforderlich, das am besten für die Makrodissektion nach dem entsprechenden H&E-Gefärbtenabschnitt geeignet ist, um dieses Protokoll erfolgreich durchzuführen.
