DNA-Methylierung ist eine der am meisten untersuchten epigenetischen Signaturen. Viele Krebsarten sind durch Veränderungen der DNA-Methylierung gekennzeichnet, die mit aberranter Genexpression und anderen genomischen Anomalien verbunden sind. Lange durchsetzte Kernelemente sind repetitive, übertragbare genomische Sequenzen, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad aufweisen.
Jedoch, Sie werden oft hypermethyliert bei Krebs, die in ihrer Aktivierung führen und führt zu chromosomalen Instabilität. In dieser Studie behandelten wir mesenchymale Stammzellen mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln, um zu sehen, ob Krebs-EVs die LINE-1-Methylierung in MECs beeinflussen können. Fetales Rinderserum, das ein integraler Bestandteil der Medien zur Zellkultur von Säugetieren ist, enthält eine große Anzahl von aus Rindern gewonnenen Elektrofahrzeugen.
Diese Evs werden die Analyse von Evs aus Zellen von unserem Interesse stören, daher ist es beim Anbau von Zellen für die EV-Isolierung wichtig, EV-erschöpfte FBS zu verwenden. Nehmen Sie FBS in Ultrazentrifugenrohren und legen Sie sie in Ultrazentrifugen-Eimer. Balancieren Sie die Eimer auf 10 Milligramm voneinander, bevor Sie sie auf einen schwingenden Rotor laden.
Den Rotor in die Ultrazentrifuge legen und bei 100.000 G 19 Stunden bei vier Grad Celsius laufen. Nach dem Lauf die hellgefärbte obere Schicht des Überstandes sorgfältig sammeln und in ein 50-Milliliter-Rohr übertragen. Stören oder pipet das dunkelbraune Pellet nicht, da es EVs von FBS enthält.
Übergeben Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Diese filtersterilisierte, EV-erschöpfte FBS kann nun beim Anbau von Zellen für die EV-Isolierung zu Zellkulturmedien hinzugefügt werden. Sammeln Sie konditionierte Medien aus Osteosarkomzellen, die in EV-erschöpften Medien angebaut werden.
Um Zellen und Zellablagerungen zu entfernen, zentrieren Sie die konditionierten Medien bei 2500 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf Ultrazentrifugenrohre und balancieren Sie sie wie früher. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 100. 000 G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie etwa einen Milliliter am Boden. Rund 20 Milliliter PBS sanft in das Rohr und die Pipette geben, um das EV-Pellet zu waschen und wieder aufzuhängen. Balancieren Sie die Rohre und führen Sie eine weitere Runde der Ultrazentrifugation mit den gleichen Einstellungen.
Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und hängen Sie das EV-Pellet in 200 Mikroliter PBS durch sanftes Pipettieren wieder auf. Bewahren Sie die Elektrofahrzeuge in bindungsarmen Rohren auf. Gereinigte Elektrofahrzeuge zeichnen sich durch Western Blotting, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie aus.
Platte 15. 000 MSCs pro Brunnen in einer 24-Well-Platte. Nach 24 Stunden alte Medien entfernen, die Zellen mit PBS waschen und auf EV-erschöpfte Medien umstellen. Behandeln Sie Zellen mit OS-EVs zu den geplanten Zeitpunkten.
Nach Beendigung der EV-Behandlung, extrahieren Sie DNA aus den Zellen mit einer geeigneten Methode. Für die Methylierungsanalyse haben wir eine maßgeschneiderte Methylierungs-spezifische Sondenverstärkungsmethode verwendet. Entwerfen Sie die maßgeschneiderten LINE-1-Sonden, wie bisher, von Pavicic und anderen.
Wählen Sie für Methylierungssonden drei Sequenzen aus, die die HhaI-Einschränkungsstelle innerhalb der Förderregion enthalten. Wählen Sie für Kontrollsonden sieben Sequenzen aus, die nicht die HhaI-Einschränkungsstelle aus dem Rest der LINE-1-Sequenz fehlen. 70 Nanogramm DNA-Probe im TE-Puffer auf fünf Mikroliter verdünnen.
Die Proben 10 Minuten bei 98 Grad Celsius erhitzen und dann auf 25 Grad Celsius abkühlen lassen. Fügen Sie jeder Probe drei Mikroliter Sondenhybridisierungsmix hinzu und führen Sie den Thermocycler aus, damit die Sonden mit der DNA hybridisieren können. Bei Raumtemperatur 30 Mikroliter Posthybridisierungsmischung zu jeder Probe hinzufügen.
10 Mikroliter in ein zweites Rohr geben. Legen Sie beide Röhrensätze in den Thermocycler und brüten Sie mindestens eine Minute lang bei 48 Grad Celsius. Während die Proben bei 48 Grad Celsius sind, fügen Sie 10 Mikroliter Ligationsmischung in den ersten Satz von Röhren und 10 Mikroliter Ligationsverdauungsmischung zum zweiten Satz von Röhren hinzu.
Führen Sie das nächste Thermocylcer-Programm aus. Dann drehen Sie die Rohre nach unten und stellen Sie gleichzeitig den Thermocycler auf 72 Grad Celsius. Fügen Sie fünf Mikroliter Polymerase-Mix zu jedem Rohr und legen Sie die Rohre in den Thermocycler.
Führen Sie das PCR-Programm aus. Während das PCR-Programm läuft, bereiten Sie eine Lösung von einem Milliliter Formamid mit 2,5 Mikroliter Größenstandard vor. Pipetten Sie 10 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Reihe einer optischen 96-Well-Platte.
Nach pcR die unverdaute und die verdaute Probe auf ein bis einhunderthundert bzw. zweihundert verdünnen, bzw. in reinem Ultrawasser. Fügen Sie zwei Mikroliter verdünntes PCR-Produkt auf die 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 G für 15 bis 20 Sekunden, um Luftblasen zu entfernen.
Durchführung der Fragmentanalyse von Proben durch Kapillarelektrophorese. Öffnen Sie die Kapillarelektrophorese ergibt eine Elektropherogramm-Analyse-Software. Wählen Sie ein Beispiel aus, und legen Sie das Bedienfeld über das Menü auf MLPA fest.
Klicken Sie auf das Bedienfeld und drücken Sie die Taste D, um diese Einstellung auf alle Proben anzuwenden. Legen Sie auf ähnliche Weise die Analysemethode für alle Proben auf Mikrosatellitenstandard fest. Wählen Sie alle Samples aus und klicken Sie auf die grüne Wiedergabeschaltfläche, um die Analyse auszuführen, dann wählen Sie alle Samples aus und klicken Sie auf die Grafikschaltfläche, um die Sondenspitzen zu visualisieren.
Zoomen Sie auf den Spitzenbereich für eine höhere Auflösung der einzelnen Spitzen. Stellen Sie sicher, dass alle 10 Spitzen, die den Sonden aus dem LINE-1-Sondenmix entsprechen, beschriftet sind. Exportieren Sie die Ergebnisse auf der Registerkarte Genotypes im CSV-Format.
Öffnen Sie die CSV-Datei in einer Datenanalysesoftware, und sortieren Sie die Daten in Spalten. Beschriften Sie die drei Methylierungs-Standortspitzen basierend auf ihrer Größe. Die restlichen sieben Spitzen entsprechen den Kontrollsonden.
Hier verwenden wir die LINE-1 2M Sondenspitzen, die eine Größe von etwa 117 Basenpaaren haben. Berechnen Sie für jede Stichprobe die Summenspitzenfläche aller sieben Kontrollspitzen. Teilen Sie den Spitzenbereich jeder LINE-1-Sonde durch diese Summe.
Teilen Sie für jede Probe den Wert der verdauten Probe durch den Wert der unverdauten Probe, um das Methylierungsdosisverhältnis zu erhalten. Die Western-Blotting-Analyse bestätigte das Vorhandensein von OS-EVs mit Signalen, die für TSG101, HSP70 und CD63 beobachtet wurden. Das Fehlen eines Calnexin-Signals deutete darauf hin, dass die EV-Probe rein war.
Zusätzliche Reinheitshinweise wurden bei TEM mit intakten Vesikeln unterschiedlicher Größe in der OS-EV-Probe beobachtet. Die OS-EV Partikelkonzentration und Größenverteilung wurde mit NTA gemessen. 80 % der Elektrofahrzeuge lagen im Größenbereich von 50 bis 200 Nanometern.
Hier können wir die Methylierungsdosisverhältnisse von LINE-1 von MSCs zu verschiedenen Zeitpunkten der EV-Behandlung sehen. Die graue Linie stellt den Basismethylierungsgrad ab dem ZeitpunktPunkt Null dar. Zum Zeitpunkt 3, Gibt es eine Abnahme der durchschnittlichen Methylierung DosierungVerhältnis nach der Verabreichung von Elektrofahrzeugen, wodurch Hypermethylierung.
Diese hypermethylierende Wirkung der Elektrofahrzeuge ist zum Zeitpunkt 7 weniger ausgeprägt. Hier haben wir eine einfache, hochempfindliche und robuste Technik für die Methylierungsanalyse gezeigt. Es erfordert eine geringe Menge an DNA ohne Bisulfit-Umwandlung beteiligt und es ist auch für DNA aus Paraffin-eingebetteten Proben isoliert geeignet.
Die gesamte Methode mit den experimentellen und analytischen Teilen dauert etwa zwei Tage. Aufgrund einer hohen Kopierzahl von LINE-1 im Genom ist die Basismethylierung von LINE-1 in normalen Proben hoch. Daher können die Unterschiede in den Methylierungsniveaus von Proben, wie bei dieser Methode beobachtet, subtil sein.
