Wir charakterisieren die In-vivo-Mechanismen der Aggregat- und Organellenextrusion aus Neuronen über einen Prozess namens Exophergenese, schlecht verstandene Biologie, die wahrscheinlich für die Ausbreitung der pathiellen Krankheitsgesinnung neurodegenerative Krankheit relevant ist. Diese Ansätze sind notwendig, um eine reproduzierbare Bewertung von extrudierten neuronalen Exophern zu erreichen und eine Plattform für die mechanistische Zerlegung der zellulären Müllelbeseitigung durch neuronale Übertragung auf benachbarte Zellen zu demonstrieren. Die Definition der In-vivo-Mechanismen, wie Neuronen Aggregate ausstoßen, kann tatsächlich die Entwicklung neuer Strategien beeinflussen, um bei der Behandlung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen zu helfen.
Für basale Bedingungen, Haus C.Elegans des gleichen biologischen Alters bei einer konstanten Temperatur von 20 Grad Celsius. Zur Live-Bildgebung der intrazellulären Dynamik und Eigenschaften der Exophergenese, legen Sie bis zu 20 Tiere auf ein Agaros-Pad auf einem Glasmikroskop-Dia und immobilisieren Sie die Tiere. Legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf über die gelähmten Würmer und legen Sie die Rutsche auf die Bühne eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops.
Verwenden Sie ein 10- bis 40-faches Ziel, um die gewünschte Z-Ebene in Brightfield zu identifizieren, wobei Sie sich die Positionierung des Wurms, die Ausrichtung des Kopfschwanzes und die Vulva-Position notieren, die Meilensteine für die spätere neuronale und exopher-Identifikation sind. Bleiben Sie in der gleichen Z-Ebene, wechseln Sie für den gewählten zytosolischen Reporter zur Weitfeldfluoreszenzanzeige bei 10 bis 40x und scrollen Sie innerhalb der Z-Achse, um die Tiefe des Tieres und die Fluoreszenzexpression in der Brennebene zu beobachten. Der Kopf wird einen fluoreszierenden Nervenring haben, und der spitzere Schwanz wird ein bis zwei sichtbare hintere laterale Berührung Neuron somas enthalten.
Höhere Vergrößerung mit einer 63x Linse kann helfen, den Nervenring, neuronale Prozesse und Soma Körper zu identifizieren. Es ist zunächst hilfreich, den Nervenring im Kopf des Tieres und laterale neuronale Prozesse zu identifizieren. Beginnen Sie dazu an der Spitze des Wurms und scrollen Sie langsam durch die Z-Achse, um die Ebene des Nervenrings zu identifizieren, an der die neuronalen Prozesse befestigt sind.
Sobald der Nervenring identifiziert wurde, folgen Sie in der Fluoreszenzansicht dem angeschlossenen neuronalen Prozess seitlich in der hinteren Richtung zur Vulva, wo das Soma sichtbar sein wird. Sobald der runde Soma Körper oder Körper im Fokus stehen, ist es wichtig, alle Neuronen in der Nähe zu identifizieren. Für die Touch-Neuron-Identifikation, zuerst finden Sie die ALML, ALMR, und AVM-Soma, die die hellsten Signale sein sollte und durch einen runden Zellkörper am Ende des Prozesses markiert werden.
Sobald das in-Fokus-Neuronaum gefunden wurde, verwenden Sie die AVM-Zelle, eine ventrale Zelle, um die Ausrichtung zuzuweisen. Wenn sich das AVM-Neuron in der gleichen Ebene wie das ALM befindet, ruht das Tier auf seiner Seite und das laterale Neuron ist der ALMR. Befindet sich das AVM-Neuron nicht in der gleichen Ebene wie die betreffende ALM, ist das ALML-Neuron das der Fokale am nächsten liegende Neuron.
Hilfreich ist auch, das PVM-Neuron zu identifizieren, das ein ventrales Touch-Neuron in der Nähe des Schwanzes ist. Die Fokusebene des PVM zeigt an, ob das vordere Touch-Neuron das ALML oder ALMR ist. Befindet sich die betreffende ALM in der gleichen Ebene wie die PVM, dann ist das beobachtete Touch-Neuron das ALML-Neuron.
Nachdem die fokussiertste ALM identifiziert und zugewiesen wurde, ist es wichtig, die Positionen der anderen Soma-Körper in der Nähe des Interessenbereichs und in allen Z-Ebenen zu bestimmen, um sie nicht mit Exophern zu verwechseln. Sobald das Berührungsneuron von Interesse gefunden wurde, die ALMR oder ALML, inspizieren Sie das Neuron für große hervorstehende Exopher-Domänen, groß genug, um als Knospenexopher betrachtet zu werden, die mindestens ein Fünftel der Größe des Ursprungssoma soma ist. Wenn keine Knospe oder Exopher-Domäne beobachtet wird, überprüfen Sie das neuronale Soma weiter auf ein angehängtes dünnes Filament, das vom Soma-Körper ausgeht.
Angefügte Exopher befinden sich in der Regel näher am Ursprungssoma und in einer ähnlichen Z-Ebene. Um einen nicht angeschlossenen Exopher zu identifizieren, suchen Sie nach konzentrierten, vertriebenen fluoreszierenden Proteinen, die oft heller sind als das Soma. Obwohl hier dargestellt, gibt es einen großen Exopher.
Es kann mehr als ein fluoreszierendes Unternehmen geben, das aus einem einzigen Soma stammt. Suchen Sie nach ungebundenen Exophern in verschiedenen Brennebenen und im entfernten seitenbereich, von wo aus das Ursprungssoma gefunden wurde. Die Exopher strudieren in der Regel in hinterer Richtung vom Soma weg vom neuronalen Prozess.
Überprüfen Sie, ob große sphärische Objekte nicht positioniert und als neuronale Somas identifiziert werden. Obwohl Exopher in der Regel sphyrische Strukturen sind, können sie im Laufe der Zeit abgebaut werden, wodurch eine unregelmäßigere Form erhalten wird. Suchen Sie nach dem Vorhandensein von Sternennachtereignissen und nach Fällen von mehreren Exopher-Ereignissen.
Um Fehleinschätzungen und außerebenen Soma für einen Exopher zu vermeiden, ist es wichtig, alle in der Nähe gelegenen Soma-Körper zu identifizieren, sogar a-fokus-Somas zu Beginn der Beobachtung. Ein verlängerter oder spitzer Soma kann beobachtet werden, aber eine Erweiterung ohne eine klare Verengungsstelle sollte nicht als Exopher bewertet werden. Lehnen Sie kleine aufgelöste Knospen ab, die bei der Quantifizierung des Exopher-Ereignisses nicht ein Fünftel der Größe des Soma erreichen.
Obwohl reife Neuriten mit dem Alter dramatisch auswachsen können und fluoreszierende Proteine in das distale Ende solcher Strukturen wandern können, zählen Sie neuriterische Auswüchse nicht als Exopher. Um fluoreszierende Einheiten zu identifizieren, die keine Exopher sind, schließen Sie jede Autofluoreszenz aus, die mit sternenförmigen nachtförmigen Ablagerungen unter Weitfeldfluoreszenz verwechselt werden kann. Um embryonale Fluoreszenzsignale auszuschließen, wechseln Sie zwischen Fluoreszenz und Hellfeldbeleuchtung, und überprüfen Sie die Assoziation des Signals mit Eiern innerhalb der Gebärmutter.
Diese Tabelle enthält eine Zusammenfassung der verschiedenen Berührungneuronen-ausgedrückten fluoreszierenden Reporter, die verwendet wurden, um die Exopher-Produktion zu überwachen. Ladungen, von denen bekannt ist, dass sie in Exophern extrudiert werden, umfassen Aggregate wie Q128, eine Fusion menschlicher Huntington-expandierter Polyglutamin-Wiederholungen, Lysosomen GFP, die mit lysosomalassoziiertem Membranprotein markiert sind, und Mitochondrien, die mit Matrix-lokalisiertem GFP markiert sind. Zytoplasmatisches GFP wird nicht stark ausgestoßen und bevorzugt im Soma beibehalten, obwohl GFP verwendet werden kann, um Exopher schwach zu visualisieren.
Im Allgemeinen beginnt die Exopher-Produktion durch die ALMR-Neuronen-exponende mCherry unter basalen Bedingungen am ersten Tag des Erwachsenenalters und reicht von etwa fünf bis 25% der ALMRs, die innerhalb des Hauptproduktionszeitrahmens des erwachsenen Tages eins bis drei untersucht werden. Besondere Belastungen und genetische Störungen können die Exopherproduktion innerhalb von ALMR-Neuronen stark erhöhen. Es ist wichtig, alle nahe gelegenen Neuronen zu lokalisieren, bevor das Neuron von Interesse und die Umgebung auf Exopher-Domains, intakte Exopher oder sternenezielle Nachtereignisse untersucht werden.
Wenn Sie es sich mit der manuellen Identifizierung von Exophern ausfühlen, können verbesserte Durchsatzmethoden für großangelegte Screenings mit hochauflösender Bildgebung eingesetzt werden, was eine vollständige Genomanalyse und eine mechanistische Exophergenese-Sektion ermöglicht.
