이 인간 신경 근육 접합 유도 시스템은 운동 뉴런, 골격 근 및 슈완 세포를 포함한 시냅스 전 및 시냅스 구성 요소의 형성을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 성숙하고 복잡한 NMJ 구조는 단일 시작 세포 집단으로부터 단일 배양 접시에서 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과 NMJ는 또한 계약할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이 방법은 척추 근육 위축과 같은 신경 근육 질환을 연구하고 치료 화합물 검사를 할 가능성이 있습니다.
분화 된 NMJ는 매우 두껍고 복잡한 조직이며 시각화하기가 어렵습니다. 절차를 시연함으로써 독자에게 특정 구조를 식별하는 방법을 지시할 수 있습니다. 페트리 접시에 세포 분리 용액 1 밀리리터를 추가하기 전에 PBS의 3 밀리리터로 세포를 씻으시다.
섭씨 37도에서 10분 후, 각 웰에 3밀리리터의 영장류 배아 줄기 세포 배지를 넣고 세 번 부드럽게 파이펫을 추가하여 커버립에서 세포를 해리시합니다. 다음으로, 분리된 줄기 세포 함유 슈퍼나티를 원심분리를 위한 50밀리리터 원전 튜브로 풀링하고, 10 마이크로몰라 Y-27632 ROCK 억제제로 보충된 신선한 영장류 배아 줄기 세포 배지의 3밀리리터에서 줄기 세포 펠릿을 재연한다. 그런 다음 ROCK 억제제 농도로 보충된 배지의 밀리리터 당 5개의 세포로 세포를 2회 10으로 희석시키고 세포외 매트릭스 코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 각 커버슬립에 2밀리리터의 세포를 반환한다.
24 시간 후에, 민체배스 배아 줄기 세포의 2밀리리터로 각각의 우물을 독시사이클린의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 보충하고 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환합니다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼네이션을 2밀리리터의 분화 배지로 잘 보충하고 10일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 되돌린다. 인큐베이션이 끝나면, 수퍼네티츠를 양분균 분화 배지의 2밀리리터로 잘 보충하고 10일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환한다.
인큐베이션이 끝나면, 슈퍼네이션을 신경근육 접합 배지의 2밀리리터로 교체하고 30일 동안 세포 배양 배양배로 플레이트를 되돌려 놓는다. 인큐베이션의 끝에서, 반전 된 현미경 검사법에 의해 차별화 된 신경 근육 접합을 시각화. 근피 수축을 트리거하려면, 분화 된 신경 근육 접합 세포의 각 우물에 25 밀리몰러 칼슘 염화 칼슘을 추가합니다.
그리고 치료 1~2분 이내에 반전된 현미경의 무대에 접시를 놓습니다. 살아있는 세포 현미경 검사를 사용하여 20 초 동안 myotube 수축의 영화를 기록하십시오. 레코딩이 끝나면 큐레어 밀리리터당 300나노그램을 배양 배지에 추가하고 분석을 위한 적절한 모션 벡터 분석 소프트웨어 프로그램에서 영화 파일을 열기 전에 20초 동안 영화를 녹화합니다.
신경필라멘트 시냅스 혈관및 아세틸콜린 수용체의 면역형염색은 뉴런을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 모터 뉴런은 TUJ 1 과 Islet 1 염색에 의해 규명될 수 있고, 시냅스 후 근시 결핵은 미신 중형 체인에 대한 염색을 통해 식별할 수 있다. 슈완 세포는 S-100 항체로 표지될 수 있다.
이러한 스캐닝 전자 현미경 이미지에서, 성숙한 신경 근육 접합의 형태는 확장된 축축단, 축축및 근육 섬유의 명확한 시각화로 관찰될 수 있다. 전염 전자 현미경 검사는 시냅스 소포와 시냅스 갈라진 부위를 가진 사전 시냅스 축슨 말단과 시냅스 후 영역을 포함한 신경 근육 성분의 성숙한 울트라 구조를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 접합은 뉴런과 근육 섬유 사이의 접합을 표시합니다.
여기서, 시냅스 소포를 포함하는 성숙한 축축 단말이 도시된다. 종합하면, 이러한 형태학적 특징은 신경 근육 성분이 잘 유도되고 성숙되었음을 나타냅니다. 세포의 기능적 평가는 눈에 띄는 신경 근육 접합 모션 신호가 염화칼슘에 의해 유도될 수 있고 이러한 수축은 운동 뉴런 신호가 근육 수축을 유발하기 위해 신경 근육 접합을 통해 전달된다는 것을 확인하는 큐라레에 의해 중단될 수 있음을 보여준다.
세포 파종 밀도는 NMJ 형성의 효율성에 영향을 미칩니다. 실험 목적에 따라 프로토콜에 적응하도록 수정할 수 있다. 이 신경 근육 접합 배양은 다중 세포 모형을 포함하고, 이 분대는 신경 근육 접합 발달 도중 또는 특정 질병 병리에 응하여 이 세포 사이 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
