Questo sistema umano di induzione della giunzione neuromuscolare può essere usato per indurre la formazione di componenti pre e post-sinaptici, inclusi motoneuroni, muscoli scheletrici e cellule di Schwann. Non solo è possibile ottenere una struttura NMJ matura e complessa in un unico piatto di coltura da un'unica popolazione di cellule di partenza, ma la NMJ risultante possiede anche la capacità di contrarsi. Questo metodo ha il potenziale per studiare le malattie neuromuscolari, come l'atrofia muscolare spinale, e per lo screening del composto terapeutico.
L'NMJ differenziato è un tessuto molto spesso e complesso, ed è difficile da visualizzare. Dimostrando la procedura, possiamo istruire i lettori su come identificare strutture specifiche. Lavare le cellule con tre millilitri di PBS prima di aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare a una piastra di Petri.
Dopo 10 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere tre millilitri di mezzo di cellule staminali embrionali primate a ciascun pozzo e pipettare delicatamente tre volte per dissociare le cellule dai copripavimenti. Successivamente, mettere in comune i supernaganti staccati contenenti cellule staminali in un tubo conico da 50 millilitri per la centrifugazione e rimescolare il pellet di cellule staminali in tre millilitri di mezzo di cellule staminali embrionali primate fresco integrato con 10 micromolare Y-27632 ROCK inibitore per il conteggio. Quindi diluire le cellule a un due per 10 alle cinque cellule per millilitro di mezzo integrato con concentrazione di inibitore ROCK e restituire due millilitri di cellule ad ogni coverlip in ogni pozzo della piastra a sei pozzetti rivestita con matrice extracellulare.
Dopo 24 ore, sostituire il supernatante in ogni pozzo con due millilitri di mezzo di cellule staminali embrionali primate fresche integrato con un microgrammo per millilitro di doxiciclina e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Al termine dell'incubazione, sostituire i supernaganti con due millilitri di mezzo di differenziazione integrati con doxiciclina per pozzo e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 10 giorni. Al termine dell'incubazione, sostituire i supernaganti con due millilitri di mezzo di differenziazione miogenica integrati con doxiciclina per pozzo e riportare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per altri 10 giorni.
Al termine dell'incubazione, sostituire i supernatinanti con due millilitri di mezzo di giunzione neuromuscolare per pozzo e restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 30 giorni. Al termine dell'incubazione, visualizzare le giunzioni neuromuscolari differenziate mediante microscopia invertita. Per innescare le contrazioni del miotubo, aggiungere 25 millimolare cloruro di calcio ad ogni pozzo di cellule di giunzione neuromuscolari differenziate.
E entro uno o due minuti dal trattamento, posizionare la piastra sul palco di un microscopio invertito. Usando la microscopia a cellule vive, registra un filmato della contrazione del miotube per 20 secondi. Alla fine della registrazione, aggiungere 300 nanogrammi per millilitro di curare al mezzo di coltura e registrare il film per altri 20 secondi prima di aprire il file filmato in un appropriato programma software di analisi del vettore di movimento per l'analisi.
La colorazione immunofluorescente dei vasi sinaptici del neurofilamento e dei recettori dell'acetilcolina può essere eseguita per identificare i neuroni. I motoneuroni potrebbero essere identificati dalla colorazione TUJ 1 e Islet 1, mentre i miotubi post-sinaptici possono essere identificati mediante colorazione per la catena pesante della miosina. Le cellule di Schwann possono essere etichettate con anticorpi S-100.
In queste immagini di microscopia elettronica a scansione, la morfologia delle giunzioni neuromuscolari mature può essere osservata con una chiara visualizzazione dei terminali axon espansi, degli assoni e delle fibre muscolari. La microscopia elettronica a trasmissione può essere usata per visualizzare l'ultrastruttura matura dei componenti neuromuscolari, incluso il terminale dell'assone presnaptico con vescicole sinaptiche e la regione post-sinaptica, che è separata dalla fessura sinaptica. Le pieghe giunzionali segnano la giunzione tra il neurone e le fibre muscolari.
Qui vengono mostrati terminali di assone maturi che contengono vescicole sinaptiche. Nel complesso, queste caratteristiche morfologiche indicano che i componenti neuromuscolari erano ben indotti e maturati. La valutazione funzionale delle cellule rivela che importanti segnali di movimento della giunzione neuromuscolare possono essere indotti dal cloruro di calcio e che queste contrazioni possono essere interrotte da curare confermando che i segnali del motoneurone vengono trasmessi attraverso la giunzione neuromuscolare per innescare la contrazione muscolare.
La densità di semina cellulare influenza l'efficienza della formazione di NMJ. Può essere modificato per adattarsi al protocollo, secondo le finalità sperimentali. Questa coltura di giunzione neuromuscolare contiene più tipi di cellule e questi componenti possono essere utilizzati per studiare le interazioni tra queste cellule durante lo sviluppo della giunzione neuromuscolare o in risposta a specifiche patologie della malattia.
