Ce système humain d’induction de jonction neuromusculaire peut être employé pour induire la formation des composants pré et post-synaptiques, y compris les neurones moteurs, le muscle squelettique, et les cellules de Schwann. Non seulement une structure mature et complexe du NMJ peut être obtenue dans un seul plat de culture à partir d’une seule population de cellules de départ, mais le NMJ qui en résulte possède également la capacité de se contracter. Cette méthode a le potentiel pour étudier des maladies neuromusculaires, telles que l’atrophie musculaire spinale, et pour le criblage thérapeutique de composé.
Le NMJ différencié est un tissu très épais et complexe, et il est difficile à visualiser. En démontrant la procédure, nous pouvons enseigner aux lecteurs comment identifier des structures spécifiques. Lavez les cellules avec trois millilitres de PBS avant d’ajouter un millilitre de solution de détachement cellulaire à une boîte de Pétri.
Après 10 minutes à 37 degrés Celsius, ajouter trois millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires primate à chaque puits et pipette doucement trois fois pour dissocier les cellules des coverslips. Ensuite, mettre en commun les supernatants contenant des cellules souches détachées dans un tube conique de 50 millilitres pour centrifugation et résuspendre la pastille de cellules souches en trois millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires de primates frais complété par 10 inhibiteurs micromolaires Y-27632 ROCK pour le comptage. Ensuite, diluer les cellules à deux fois 10 à cinq cellules par millilitre de milieu complété par la concentration inhibiteur rock et retourner deux millilitres de cellules à chaque coverslip dans chaque puits de la matrice extracellulaire enduite de six puits plaque.
Après 24 heures, remplacer le supernatant dans chaque puits par deux millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires primates frais complété par un microgramme par millilitre de doxycycline et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par deux millilitres de milieu de différenciation complétés par de la doxycycline par puits et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 jours. À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par deux millilitres de milieu de différenciation myogénique complété par de la doxycycline par puits et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 jours supplémentaires.
À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par deux millilitres de milieu de jonction neuromusculaire par puits et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 jours. À la fin de l’incubation, visualiser les jonctions neuromusculaires différenciées par microscopie inversée. Pour déclencher les contractions myotube, ajouter 25 millimolaire chlorure de calcium à chaque puits de cellules de jonction neuromusculaire différenciée.
Et dans un délai d’une à deux minutes de traitement, placez la plaque sur la scène d’un microscope inversé. À l’aide d’une microscopie cellulaire vivante, enregistrez un film de la contraction du myotube pendant 20 secondes. À la fin de l’enregistrement, ajouter 300 nanogrammes par millilitre de curare au milieu de la culture et enregistrer le film pendant encore 20 secondes avant d’ouvrir le fichier de film dans un logiciel approprié d’analyse vectorielle de mouvement pour l’analyse.
La coloration immunofluorescente des vaisseaux synaptiques de neurofilament et des récepteurs d’acétylcholine peut être exécutée pour identifier les neurones. Les motoneurones pourraient être identifiés par tuj 1 et islet 1 colorant, tandis que les myotubes post-synaptiques peuvent être identifiés en souinant pour la chaîne lourde de myosine. Les cellules de Schwann peuvent être étiquetées avec des anticorps S-100.
Dans ces images de microscopie électronique de balayage, la morphologie des jonctions neuromusculaires mûres peut être observée avec la visualisation claire des terminaux élargis d’axon, des axones, et des fibres musculaires. La microscopie électronique de transmission peut être employée pour visualiser la structure ultra mature des composants neuromusculaires, y compris le terminal présynaptique d’axon avec des vésicules synaptiques et la région post-synaptique, qui est séparée par la fissure synaptique. Les plis jonctionnels marquent la jonction entre le neurone et les fibres musculaires.
Ici, les terminaux d’axons matures qui contiennent des vésicules synaptiques sont montrés. Pris ensemble, ces dispositifs morphologiques indiquent que les composants neuromusculaires ont été bien induits et mûris. L’évaluation fonctionnelle des cellules révèle que les signaux neuromusculaires proéminents de mouvement de jonction peuvent être induits par le chlorure de calcium et que ces contractions peuvent être interrompues par curare confirmant que les signaux de neurone moteur sont transmis par la jonction neuromusculaire pour déclencher la contraction de muscle.
La densité d’ensemencement cellulaire influe sur l’efficacité de la formation de NMJ. Il peut être modifié pour s’adapter au protocole, selon les objectifs expérimentaux. Cette culture de jonction neuromusculaire contient plusieurs types de cellules, et ces composants peuvent être utilisés pour étudier les interactions entre ces cellules lors du développement de jonctions neuromusculaires ou en réponse à des pathologies spécifiques de la maladie.
