ヒト人工多能性幹細胞から誘導されるインビトロ神経筋接合

このヒト神経筋接合誘導システムは、運動ニューロン、骨格筋、シュワン細胞を含むシナプス前およびシナプス後の成分の形成を誘導するために使用することができる。成熟した複雑なNMJ構造は、単一の開始細胞集団から単一の培養皿で得られるだけでなく、得られたNMJは収縮する能力も有する。この方法は、脊髄性筋萎縮症などの神経筋疾患を研究し、治療的な化合物スクリーニングを行う可能性を秘めています。

分化されたNMJは非常に厚く、複雑な組織であり、視覚化することは困難です。この手順をデモンストレーションすることで、特定の構造を特定する方法を読者に指示できます。ペトリ皿に1ミリリットルの細胞剥離液を加える前に、PBSの3ミリリットルで細胞を洗います。

摂氏37度で10分後、霊長類胚性幹細胞培地3ミリリットルを各ウェルに加え、軽くピペットを3回加えて、カバーリップから細胞を解離する。次に、分離した幹細胞含有上清を遠心分離用の50ミリリットル円錐形チューブにプールし、10マイクロモルY-27632 ROCK阻害剤を添加した新鮮な霊長類胚性幹細胞培地の3ミリリットルで幹細胞ペレットを再懸濁する。その後、ROCK阻害剤濃度を補った培地1ミリリットル当たり5細胞に細胞を2倍10倍希釈し、細胞外マトリックスコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルの各カバースリップに2ミリリットルの細胞を戻します。

24時間後、各ウェルの上澄み液を、ドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムで補った新鮮な霊長類胚性幹細胞培地の2ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間戻す。インキュベーションの終了時に、上清を1ウェル当たりドキシサイクリンを添加した分化培地2ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに10日間戻します。インキュベーションの終了時に、上清をウェル当たりドキシサイクリンを添加した2ミリリットルの筋原性分化培地に置き換え、さらに10日間プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。

インキュベーションの終わりに、上清をウェルあたり2ミリリットルの神経筋接合剤培地に置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに30日間戻します。インキュベーションの終了時に、逆顕微鏡による分化された神経筋接合部を可視化します。筋管収縮を引き起こすには、分化した神経筋接合細胞の各ウェルに25ミリモル塩化カルシウムを加える。

そして、治療の1〜2分以内に、逆顕微鏡のステージ上にプレートを置きます。ライブ細胞顕微鏡を用いて、20秒間、筋管収縮の動画を記録する。記録の最後に、培養培地に1ミリリットル当たり300ナノグラムを添加し、ムービーを20秒間記録してから、ムービーファイルを適切なモーションベクトル解析ソフトウェアプログラムで開いて分析します。

神経フィラメントシナプス血管およびアセチルコリン受容体の免疫蛍光染色は、ニューロンを同定するために行うことができる。運動ニューロンはTUJ 1と膵門1染色によって同定することができ、シナプス後筋管はミオシン重鎖の染色によって同定することができる。シュワン細胞は、S-100抗体で標識することができる。

これらの走査型電子顕微鏡画像では、成長した軸索末端、軸索、および筋線維の明確な可視化により、成熟した神経筋接合の形態を観察することができる。透過電子顕微鏡は、シナプス小胞を有するシナプス前軸索末端およびシナプス裂裂によって分離されたシナプス後領域を含む神経筋成分の成熟した超構造を可視化するために使用することができる。接合折り目は、ニューロンと筋線維の間の接合部をマークします。

ここでは、シナプス小胞を含む成熟した軸索末端が示されている。まとめると、これらの形態学的特徴は、神経筋成分が十分に誘発され、成熟したことを示す。細胞の機能的評価は、顕著な神経筋接合運動信号が塩化カルシウムによって誘発され、これらの収縮は、運動ニューロン信号が神経筋接合部を介して伝達され、筋肉収縮を引き起こすことを確認することによって中断することができることを明らかにする。

細胞の播種密度はNMJ形成の効率に影響を与える。実験目的に従って、プロトコルに適応するように変更することができる。この神経筋接合部培養は複数の細胞タイプを含み、これらの成分は、神経筋接合の発達中または特定の疾患病理に応答してこれらの細胞間の相互作用を研究するために使用することができる。