Die Studie wurde durch die Fördernummern NCI P30 CA023108 und NCI U54 CA151662 finanziert.

Das Dartmouth College Animal Care and Use Program ist von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) akkreditiert und hält sich an alle Richtlinien und Vorschriften von UDSA und NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alle In-vivo-Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Das Euthanasieverfahren entspricht den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren aus dem Jahr 2020.
1. Instrumentierung/Aufbau des Systems
<ol><li>Entwerfen Sie eine benutzerdefinierte AMF-Antenne (Spule) als geschlossene Schleife und wählen Sie Formen aus, um das gewünschte Magnetfeld zu erzeugen. Verwenden Sie Induktivitätsformeln und Eigenschaften aus der Auswahl des Stromgenerators, um kompatible Spulen zu entwerfen, um das gewünschte Feld zu erzeugen. Verwenden Sie unterschiedliche Designs für In-vitro- und In-vivo-Experimente.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Induktivität der AMF-Antenne innerhalb des akzeptablen Bereichs des Stromgenerators liegt. Fügen Sie Kondensatoren hinzu oder subtrahieren Sie sie, um die Antenne an den Stromgenerator anzupassen (abzustimmen).</li>
	<li>Entwerfen Sie für In-vitro-Experimente eine spiralförmige Spule mit 14 Windungen und einem Innendurchmesser von 2 cm und einer Länge von 14 cm, die 1,5-ml-Röhrchen enthalten kann, so dass mehrere Proben gleichzeitig behandelt werden können. Isolieren Sie die Spule mit einem Vinylpolymer und verwenden Sie einen Styropor-Abstandhalter, um die Spule von den Rohren zu trennen. Einzelheiten zu den Entwurfsspezifikationen und -überlegungen sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.</li>
	<li>Erwerben Sie für In-vivo-Experimente eine speziell angefertigte Ganzkörper-Spiralspule von einem Hersteller mit proprietären Designinformationen. Verwenden Sie einen 8-mm-Vierkantschlauch (da dies ein gleichmäßigeres Feld innerhalb der Bohrung der Spule erzeugt) und einen Konzentrator im Zielbehandlungsbereich. Machen Sie den Konzentrator 5,0 cm lang, mit insgesamt 5 Umdrehungen, was zu einem Innendurchmesser von 3,6 cm und einem Außendurchmesser von 5,2 cm führt, und positionieren Sie sich im Zielbereich. Umgeben Sie die Spule mit einer Polycarbonat-Schale.</li>
	<li>Verwenden Sie einen AMF-Generator mit einstellbarer Leistung und Frequenz von 10 kW oder mehr als Stromquelle. Die Induktivität passt die Stromquelle und die Antennen/Spulen auf einen Bereich von 0,62 bis 1,18 μHenries (μH) an, was Frequenzen zwischen 30 und 300 kHz ermöglicht. Kühlen Sie den Generator mit recyceltem Wasser durch eine Zentrifugalpumpe, deren Druck auf 50 psi geregelt ist.</li>
	<li>Kühlen Sie die Spulen mit einem Kühler mit einer Kühlleistung von 5,6 Tonnen, der 25% Wärmeträgerflüssigkeit auf Ethylenglykolbasis, die mit Wasser verdünnt ist, durch die AMF-Antenne pumpt. Stellen Sie die Temperatur des Kühlers so ein, dass die Antenne die Probe nicht erwärmt oder kühlt.</li>
	<li>Für die Tiereindämmung konstruieren Sie einen schlauchförmigen Halter, der in der Mitte der Spule mit einem Luftspalt von 0,5 cm zwischen dem Halter und der Spulenoberfläche aufgehängt werden kann. Schließen Sie eine einstellbare konditionierte Luftpumpe an, die Luft durch die Schale um die Spule zirkulieren lässt, und stellen Sie sie so ein, dass sie eine normale Tierkerntemperatur aufrechterhält. Verbinden Sie das Anästhesiegerät mit dem röhrenförmigen Tierhalter in der Nähe des Kopfes des Tieres, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.</li>
	<li>Erstellen Sie für die Zelleindämmung eine Vorrichtung, die Wasser aus einem Wasserbad durch den Abstandshalter zirkulieren lässt, in dem sich die Schläuche befinden. Stellen Sie die Temperatur dieses Wasserbades so ein, dass die Rohre von Wasser bei 37 °C umgeben sind.</li>
	<li>Verwenden Sie faseroptische Sonden, um die Temperaturen innerhalb des Tumors, des Tierkerns und der Tierumgebung zu überwachen, oder für In-vitro-Studien, um die Temperatur des Zellpellets und des Wassers, das die Röhrchen umgibt, zu überwachen.</li>
	<li>Verwenden Sie magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Größe von 100 nm für alle Experimente. ANMERKUNG: Konzentration und spezifische Absorptionsrate (SAR) sind zwei Merkmale, die bei der Auswahl von Nanopartikeln berücksichtigt werden müssen, da sie sich direkt auf die mögliche Wärme- und Wärmedosis auswirken18.</li>
</ol>2. Hyperthermie in vitro
<ol><li>Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Platte 150.000 Zellen/Well in 6-Well-Platten mit 2 mL vollständigem Medium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die geeignete Behandlung für jede Vertiefung, d.h. Zellen ohne mNPs und ohne AMF, Zellen mit mNPs und ohne AMF, Zellen ohne mNPs und AMF, Zellen mit mNPs und AMF. HINWEIS: Stellen Sie außerdem sicher, dass geeignete Kontrollen vorhanden sind, wenn Sie Hyperthermie mit einer anderen Therapie kombinieren. AMF wird in einem Standard-Forschungslabor durchgeführt, das mit den erforderlichen Strom- und Kühlkapazitäten nachgerüstet ist.</li>
	<li>24 Stunden nach der Beschichtung mNPs in die entsprechenden Vertiefungen geben, wie im vorherigen Schritt bestimmt. Fügen Sie mNPs zu einer Konzentration von 3 mg Eisen / ml hinzu. Stellen Sie sicher, dass die mNPs im gesamten Bohrloch verteilt sind, indem Sie entweder eine Standardmedien/mNP-Lösung erstellen (alte Medien entfernen, diese Lösung hinzufügen) oder indem Sie die mNPs direkt und sanft wirbelnde Platten hinzufügen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Beginnen Sie die Behandlung 48 Stunden nach der Zugabe von mNPs, wenn die Wells ~ 80% konfluent sind, indem Sie das Medium entfernen und die Wells mit frischen Medien waschen. Entfernen Sie das Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml Trypsin zu jedem behandelten Wohlbefinden hinzu und schwenken Sie es sanft. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen abgelöst sind.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml Medium in jede Vertiefung, um die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen zu sammeln. Sammeln Sie alle Zellen aus dem Brunnen (~ 1 x 106 Zellen). Verwenden Sie für jede Vertiefung ein deutlich beschriftetes separates Röhrchen.</li>
	<li>Spinnröhrchen bei 60 x g für 2-3 min, damit die Zellen pelletieren können. Bewahren Sie das Pellet im Medium auf.</li>
	<li>Legen Sie die Schläuche in den mit Wasser gefüllten Abstandhalter in der Spule. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass das Medium und das Zellpellet auf 37 °C gehalten werden. Überwachen Sie die Temperatur innerhalb der Röhre und des Wasserbades mit separaten faseroptischen Temperaturfühlern.</li>
	<li>Schalten Sie den Kühler ein und überprüfen Sie, ob das Kühlmittel durch die Spule fließt. Schalten Sie die Stromquelle ein, und stellen Sie den Prozentsatz des Maximums auf das gewünschte Feld ein. Betreiben Sie die 14-Gang-Magnetspule, die von einem 10-kW-Generator gespeist wird, bei 165 kHz und 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Platzieren Sie einen separaten faseroptischen Temperaturfühler in einem der Rohre. Behandeln Sie die Zellen bis zur zuvor festgelegten thermischen Protokolldosis. Ein Beispiel ist 30 min bei 43 °C (CEM43 von 30).</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in den Medien, die sich in ihren Röhrchen befinden, und beschichten Sie sie in neue 6-Well-Platten. Beschriften Sie die neuen Schilder deutlich. Das Ziel ist es, alle gesammelten Zellen (~ 1 x 106 Zellen) neu zu beschichten. HINWEIS: Es sollten neue 6-Well-Platten verwendet werden, um sicherzustellen, dass die zu kultivierenden Zellen behandelt werden. Wenn die alten Platten verwendet werden, können immer noch Zellen auf den Platten verbleiben, die nicht erfolgreich trypsinisiert wurden.</li>
	<li>Falls erforderlich, für das nächste experimentelle Verfahren, lysieren Sie die Zellen für die RNA- oder Proteinexpressionsanalyse.</li>
</ol>3. Hyperthermie in vivo
<ol><li>Zellkultur und Impfung<ol><li>Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Verwenden Sie Teller / Schüsseln, die genügend Zellen für die Impfung der gewünschten Anzahl von Tieren liefern. Zum Beispiel werden 10, 100 mm Schalen, die mit 100.000 Zellen plattiert sind, mit genügend Zellen für 20 Mäuseinjektionen innerhalb von 48 Stunden konfluieren.</li>
		<li>Trypsinisieren Sie die Zellen und sammeln Sie sie mit reinem RPMI-Medium (kein FBS oder Pen/Streptokokken).</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen und erstellen Sie eine Lösung für die gewünschte Zellkonzentration, basierend auf dem Impfvolumen und der Anzahl der Mäuse.</li>
		<li>Betäuben Sie 6 Wochen alte weibliche C57Bl/6-Mäuse mit verdampftem Isofluran und Sauerstoff. Legen Sie die Tiere in einen Plexiglaskasten mit 5% Isofluran und 95% Sauerstoff, bis sie induziert sind. Nach der Induktion wird das Tier entnommen und ein Stirnkegel mit 2 % Isofluran verwendet, um die Schritte 3.1.5-3.1.7 und 3.3.3-3.3.6 abzuschließen. HINWEIS: Für die Anästhesie während der Behandlung verwenden Sie eine eingebaute Anästhesieeindämmung. Befolgen Sie die institutionellen Standardprotokolle für die Anästhesie der Maus. Stellen Sie vor dem Tierversuch eine entsprechende IACUC-Zulassung sicher. Bringen Sie das Tier nach der Anästhesie in den Käfig zurück und überwachen Sie die Genesung, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen auftreten.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren.</li>
		<li>Rasieren Sie die rechte Flanke mit einem Elektrorasierer.</li>
		<li>Reinigen Sie den Injektionsbereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie 1-2 x 106 Zellen mit einer 100 μL Glasspritze mit einer 28 G Nadel, dispergiert in 50 μL Medien intradermal auf der rasierten rechten Flanke der Anästhesie.</li>
	</ol></li>
	<li>Tumorwachstum/Nanopartikel-Injektion<ol><li>Messen Sie Tumore in 3 Dimensionen mit Messschiebern (Länge, Breite und Tiefe) und berechnen Sie Volumina nach (Länge x Breite x Tiefe x π)/6.</li>
		<li>Wenn das Tumorvolumen 120 mm3 (+/- 20mm3) erreicht, werden die Tiere untersucht. Entwerfen Sie die Studie und stellen Sie sicher, dass es geeignete Kontroll- und Behandlungsgruppen gibt, einschließlich Kombinationstherapie-Kohorten (d. h. Kontrolle, mNPH, Bestrahlung und die Kombination).</li>
		<li>Betäubung von Mäusen, die mNPs erhalten, wie in 3.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Reinigen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie mNPs 3 h vor der AMF-Behandlung in den Tumor. Injizieren Sie ein Volumen, so dass die Dosis 7,5 mg Eisen / cm3 des Tumors beträgt. HINWEIS: Unveröffentlichte Daten aus dem Labor deuten darauf hin, dass die maximale mNP-Aufnahme nach 3-6 Stunden erfolgt.</li>
	</ol></li>
	<li>AMF-Behandlung<ol><li>Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf ein Heizkissen, um die Kerntemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren. Entfernen Sie die Ohrmarke oder andere Metallgegenstände an der Maus.</li>
		<li>Setzen Sie vorsichtig einen geschmierten faseroptischen Temperaturfühler in das Rektum der Maus ein.</li>
		<li>Legen Sie einen Katheter in den Tumor und entfernen Sie die Nadel. Schneiden Sie den Katheter so, dass er nicht zu sehr aus dem Tumor herausragt. HINWEIS: Die faseroptischen Temperaturkatheter werden platziert und entfernt, während sich die Mäuse unter Vollnarkose befinden, d.h. die Katheter sind nur während der Tumorerwärmung an Ort und Stelle. Mäuse erhalten zum Zeitpunkt des Eingriffs eine subkutane Einzeldosis eines NSAID-Analgesiemedikaments, Ketoprofen (5 mg/kg). Wir haben keine kurz- oder langfristigen Beschwerden oder Morbiditäten im Zusammenhang mit der Platzierung der Katheter beobachtet.</li>
		<li>Führen Sie einen faseroptischen 3-Sensor-Temperaturfühler in den Katheter ein. Der Katheter schützt die faseroptischen Temperaturfühlersensoren.</li>
		<li>Kleben Sie die rektale und intratumorale Sonde an den Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass sie an Ort und Stelle bleiben.</li>
		<li>Legen Sie die Maus in ein 50-ml-Röhrchen und gehen Sie mit dem Kopf nach unten. Der Schlauch sollte ein Loch in der Nähe des Kopfes haben, wo die Anästhesie angeschlossen und abgegeben wird.</li>
		<li>Legen Sie den Schlauch in die Spule und schließen Sie die Anästhesie wieder an.</li>
		<li>Legen Sie einen faseroptischen Temperaturfühler locker in die Röhre, um die Umgebungstemperatur zu messen.</li>
		<li>Schalten Sie den Kühler ein und stellen Sie sicher, dass das Kühlmittel zirkuliert.</li>
		<li>Überprüfen und stellen Sie sicher, dass die Computersoftware die verschiedenen Temperaturen anzeigt, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, damit eine CEM43-Berechnung in Echtzeit angezeigt werden kann. Das erforderliche CEM43 ist die zuvor festgelegte Dosis. HINWEIS: Bevor der Magnet eingeschaltet wird, stellen Sie sicher, dass keine Metallgegenstände am Tier befestigt sind, da sich diese schnell erwärmen. Stellen Sie außerdem sicher, dass jeder im Raum keinen Herzschrittmacher hat und es für sie sicher ist, dort zu sein.</li>
		<li>Schalten Sie den Magneten bei einem niedrigen Leistungsprozentsatz ein.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die faseroptischen Temperaturfühler Temperaturänderungen aufzeichnen. Die Temperaturen steigen an, sobald das AMF aktiviert wird, wenn das Feld zunimmt. Stellen Sie sicher, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 38 °C bleibt. Regulieren Sie die Kerntemperatur mit dem klimatisierten Luftmantel.</li>
		<li>Passen Sie die Stärke des Magnetfeldes an, indem Sie die Leistung des Generators mit dem eingebauten Einstellrad ändern, das wiederum das Temperaturniveau im Tumor steuert.</li>
		<li>Schalten Sie die AMF ab, sobald die gewünschte Dosis, wie sie zuvor vom Benutzer bestimmt wurde (z. B. CEM43 40), innerhalb des Tumors erreicht ist.</li>
		<li>Sobald die AMF abgeschaltet ist, entfernen Sie den Schlauch von der Spule.</li>
		<li>Nehmen Sie die Maus aus dem Röhrchen und ziehen Sie die verschiedenen Sonden und den Katheter heraus. Wenn nötig, markieren Sie das Tier mit einer neuen Ohrmarke aus Metall.</li>
		<li>Sobald die Behandlungen abgeschlossen sind, schalten Sie den Kühler aus.</li>
		<li>Erholen Sie die Tiere aus der Narkose, um Komplikationen zu vermeiden. Überwachen Sie ihr Verhalten, um sicherzustellen, dass sie zur Normalität zurückkehren.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Design und die Implementierung dieses Systems bietet die Möglichkeit, genaue und reproduzierbare In-vitro- und In-vivo-Experimente zur magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie durchzuführen. Es ist wichtig, dass das System so ausgelegt ist, dass die AMF-Frequenz und die Feldstärke angemessen auf den magnetischen Nanopartikeltyp, die Konzentration und die gewünschte Gewebeposition und -temperatur abgestimmt sind. Darüber hinaus ist die genaue Überwachung der Temperatur in Echtzeit entscheidend für die Sicherheit ...

Hyperthermie wurde in der Vergangenheit in der Krebstherapie eingesetzt, entweder allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen. Obwohl es eine lange Geschichte der Verwendung hat, wird die vorteilhafteste Methode zur Verabreichung dieser Behandlung immer noch diskutiert und hängt vom Krankheitsort und -ort ab. Zu den Verfahren zur Hyperthermieabgabe gehören Mikrowellen-, Hochfrequenz-, fokussierter Ultraschall, Laser und metallische Nanopartikel (wie Gold oder Eisenoxid)1,2,3,4. Diese Verabreichungsmethoden können zu einer Reihe von Behandlungstemperaturen von Fieber bis zu Hunderten von Grad Celsius führen. Die biologische Wirkung der Hyperthermie hängt in erster Linie von den verwendeten Temperaturen und der Dauer der Behandlungab 5. Für dieses Manuskript und Zweck konzentrieren wir uns auf die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Diese Methode ermöglicht fokussierte, lokalisierte, gut überwachte und kontrollierte Temperaturänderungen unter Verwendung von ungiftigen, von der FDA zugelassenen Eisenoxid-Nanopartikeln.
Ein Fallstrick bei anderen Hyperthermie-Modalitäten ist das Fehlen eines präzisen zellulären Targetings. Hyperthermie hat kein inhärent hohes therapeutisches Verhältnis, daher ist eine sorgfältige Thermometrie und gezieltes Targeting erforderlich6. mNPH ermöglicht die systemische oder intratumorale Injektion von mNPs, wobei Wärme nur dort erzeugt wird, wo sich die mNPs befinden, wodurch die Behandlung direkt auf den Tumor ausgerichtet ist. mNPH kann wirksam sein, wenn sich die magnetischen Nanopartikel innerhalb oder außerhalb der Zelle befinden. Für die Krebstherapie ist die allgemeine Übersicht von mNPH, dass die magnetischen Nanopartikel injiziert werden (intratumoral oder intravenös), dann wird ein magnetisches Wechselfeld angelegt, wodurch sich die magnetischen Pole der Nanopartikel ständig neu ausrichten, was zu einer lokalen Erwärmung der Zellen und des Gewebes führt, die mit den Nanopartikeln assoziiertsind 7,8 . Durch die Einstellung des Volumens der Nanopartikel und der Frequenz/Stärke des magnetischen Wechselfeldes (AMF) ist es möglich, die im Gewebe erzeugte Temperatur sorgfältig zu steuern.
Diese Behandlung funktioniert gut bei Tumoren, die sich in der Nähe der Körperoberfläche befinden, da tiefere Tumore eine stärkere AMF erfordern, so dass das Risiko einer Wirbelstromerwärmung steigt9. Es gibt Hinweise darauf, dass Hyperthermie klinisch als Monotherapie eingesetzt wird, jedoch wird Hyperthermie oft mit einer Strahlentherapie oder Chemotherapie kombiniert, was zu einer gezielteren Anti-Krebs-Wirkung führt10,11,12. Der klinische Nachweis von Hyperthermie in Kombination mit einer Strahlentherapie wurde in einer früheren Veröffentlichungüberprüft 13. Unser Labor hat eine Vielzahl von Tieren, von Mäusen über Schweine bis hin zu spontanen Krebserkrankungen bei Hunden, mit der mNPH-Methode12,14,15 erfolgreich behandelt. Dieses Protokoll richtet sich an alle, die daran interessiert sind, die Auswirkungen einer lokalisierten Hyperthermiebehandlung allein oder in Kombination mit anderen Therapien zu untersuchen.
Einer der wichtigsten Faktoren bei der Hyperthermie ist die Fähigkeit, die thermische Dosis, die an das Ziel-/Tumorgewebe abgegeben wird, in Echtzeit zu messen und zu verstehen. Eine Standardmethode zur Berechnung und zum Vergleich der Dosis ist der Nachweis der kumulativen äquivalenten Erhitzungsminuten bei 43 °C. Dieser Algorithmus ermöglicht den Vergleich von Dosen unabhängig vom Abgabesystem, maximalen und minimalen Temperaturen (innerhalb eines bestimmten Bereichs) und Aufheiz-/Abkühlparametern 5,16. Die CEM-Berechnung funktioniert am besten für Temperaturen zwischen 39-57 °C5. Zum Beispiel haben wir in einigen der von uns durchgeführten Studien eine thermische Dosis von CEM43 30 (d.h. 30 min bei 43 °C) gewählt. Die Wahl dieser Dosis ermöglichte es uns, eine sichere, wirksame, immungenetische Wirkung in vitro zu untersuchen, sowohl allein als auch in Kombination mit einer EinzeldosisStrahlung 17.
Bei der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie gibt es mehrere Faktoren, die beim Aufbau eines geeigneten Verabreichungssystems berücksichtigt werden müssen. Das Instrumentierungsdesign umfasst wichtige Sicherheitsfaktoren, wie z. B. die Verwendung eines Kühlers, um sicherzustellen, dass die Magnetfeldübertragungsgeräte auch bei hoher Leistung kühl bleiben, und ausfallsichere Verfahren, die verhindern, dass das System eingeschaltet wird, wenn nicht alle Temperatur-, Leistungsbewertungs- und Steuerungssysteme aktiviert wurden. Darüber hinaus gibt es wichtige biologische Faktoren, die sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Situationen berücksichtigt werden müssen. Bei der Verwendung von kultivierten Zellen ist es notwendig, in Wachstumsmedien zu behandeln und auf einer konstanten lebensfähigen Temperatur zu halten, um physiologische Veränderungen zu vermeiden, die die Ergebnisse beeinflussen könnten. Für einzelne Nanopartikeltypen ist es wichtig, die spezifische Absorptionsrate (SAR) zu kennen, wenn AMF-basierte Heizparameter berechnet werden. Ebenso ist es wichtig, die mNP/Fe-Konzentration in Zellen und Geweben zu kennen, die notwendig ist, um die gewünschte Erwärmung zu erreichen. In-vivo-Methoden erfordern noch mehr Liebe zum Detail, da das Tier während der Behandlung unter Narkose gehalten werden muss und die Körperkerntemperatur des Tieres während der gesamten Behandlung auf einem normalen Niveau gehalten werden muss. Wenn die Körpertemperatur des Tieres sinkt, wie dies unter Narkose der Fall ist, kann dies das Gesamtergebnis in Bezug auf die thermische Dosis des zu behandelnden Gewebes beeinflussen.
In diesem Manuskript diskutieren wir die Methoden, die verwendet werden, um ein vielseitiges magnetisches Nanopartikel-Hyperthermiesystem zu entwerfen und zu konstruieren, sowie wichtige Anwendungsfaktoren, die berücksichtigt werden müssen. Das beschriebene System ermöglicht die robuste, konsistente, biologisch angemessene, sichere und gut kontrollierte Abgabe von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie. Schließlich ist zu beachten, dass die von uns durchgeführten mNPH-Studien häufig andere Therapien wie Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie beinhalten. Damit diese Ergebnisse aussagekräftig sind, ist es wichtig zu bestimmen, wie sich die abgegebene Wärme auf die Wirksamkeit und/oder Sicherheitstoxizität anderer Modalitäten (oder umgekehrt) und das Wohlbefinden des Tieres auswirken kann. Aus diesem Grund und den zuvor genannten Dosimetrie- und Therapiesituationen ist es unerlässlich, der Dosiergenauigkeit der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie und den kontinuierlichen Kern- und Zieltemperaturmessungen strikte Aufmerksamkeit zu schenken. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache, konsistente Methode und Beschreibung für die Bereitstellung einer sicheren und effektiven magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>.25% Trypsin</td><td>Corning</td><td>45000-664</td><td>available from many companies</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 22363204</td><td>available from many companies</td></tr><tr><td>B16F10 murine melanoma cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>C57/Bl6 mice</td><td>Charles river</td><td>027C57BL/6</td><td>6-week-old female mice</td></tr><tr><td>Chiller</td><td>Thermal Care</td><td>NQ 5 series</td><td>chiller that cools the coil</td></tr><tr><td>Coolant fluid</td><td>Dow Chemical Company</td><td>Dowtherm SR-1</td><td>antenna cooling fluid</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071</td><td>available from many companies</td></tr><tr><td>fiber optic probes, software and chassis</td><td>FISO</td><td></td><td>FISO evolution software used to read the temperatures</td></tr><tr><td>IR camera</td><td>Flir</td><td></td><td>infrared camera to monitor unintentional heating</td></tr><tr><td>iron oxide nanoparticles</td><td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td><td>Bionized NanoFerrite</td><td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td></tr><tr><td>mouse coil, solenoid</td><td>Fluxtrol</td><td>custom built</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>45000-652</td><td>available from many companies</td></tr><tr><td>RF generator</td><td>Huttinger</td><td>TIG 10/300</td><td>power source</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Corning</td><td>45000-396</td><td>available from many companies</td></tr></tbody></table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

Hyperthermie wird seit langem bei der Behandlung von Krebs eingesetzt. Die Techniken reichen von der intratumoralen Einführung von heißen Eisenstäben bis hin zu systemisch verabreichten magnetischen Nanopartikeln, die auf Tumorantikörper abzielen, bei Temperaturen von 39 °C (Fieber) bis 1.000 °C (Elektrokauterisation) und Behandlungszeiten von Sekunden bis Stunden. Die Temperatur-Zeit-Beziehung (thermische Dosis) bestimmt die Wirkung mit hohen thermischen Dosen, die zur Gewebeablation führen, und niedrigeren thermischen Dosen, die zu subletalen Effekten wie erhöhtem Blutfluss, Akkumulation von Medikamenten und Immunstimulation führen. Eine der vielversprechendsten medizinischen Therapien ist die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Bei dieser Technik werden magnetische Nanopartikel, die systemisch oder intratumoral abgegeben werden können, mit einem nicht-invasiven, nicht-toxischen magnetischen Wechselfeld aktiviert. Die Größe, der Aufbau und die Assoziation der magnetischen Nanopartikel sowie die Frequenz und Feldstärke des Magnetfeldes sind wichtige Erwärmungsdeterminanten. Wir haben ausgeklügelte Instrumente und Techniken entwickelt, um eine reproduzierbare magnetische Nanopartikel-Hyperthermie in großen und kleinen Tiermodellen und kultivierten Zellen zu ermöglichen. Dieser Ansatz, der eine kontinuierliche Echtzeit-Temperaturüberwachung an mehreren Standorten verwendet, ermöglicht die Abgabe genau definierter thermischer Dosen an das Zielgewebe (Tumor) oder die Zielzellen, während die Erwärmung des Nicht-Zielgewebes begrenzt wird. Die präzise Steuerung und Überwachung der Temperatur an mehreren Standorten und die Verwendung des Industriestandardalgorithmus (kumulative äquivalente Minuten bei 43 °C /CEM43) ermöglichen eine genaue Bestimmung und Quantifizierung der thermischen Dosis. Unser System, das eine Vielzahl von Temperaturen, thermischen Dosen und biologischen Effekten ermöglicht, wurde durch eine Kombination aus kommerziellen Akquisitionen und internen technischen und biologischen Entwicklungen entwickelt. Dieses System wurde so optimiert, dass eine schnelle Umstellung zwischen Ex-vivo-, In-vitro- und In-vivo-Techniken möglich ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie eine effektive Technik und ein System zur Bereitstellung einer reproduzierbaren und genauen magnetischen Nanopartikeltherapie (mNP) Hyperthermie entworfen, entwickelt und implementiert werden können.

In-vitro-Studien Zellen erreichen und halten die gewünschte Temperatur und thermische Dosis nur dann aufrecht, wenn die Menge und Konzentration der magnetischen Nanopartikel / Eisen und der AMF entsprechend abgestimmt sind. Bei der Verwendung von magnetischen Nanopartikeln zur Erwärmung von Zellen in vitro (und in vivo) sollte beachtet werden, dass zur Erzielung einer Hyperthermie in Zellen mit internalisierten magnetischen Nanopartikeln ein bestimmtes Maß an intrazellulärem mNP / Fe erforderlich ...

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für die genaue Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie unter Verwendung eines ausgeklügelten Verabreichungs- und Überwachungssystems erforderlich sind.

In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Forschung

Medizin

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Biotechnik

Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model

Magnetic resonance-guided high intensity focused ultrasound (MRgHIFU) is an established method for producing localized hyperthermia. Given the real-time imaging and acoustic energy modulation, this modality enables precise temperature control within a defined area. Many thermal applications are being explored with this noninvasive, nonionizing technology, such as hyperthermia generation, to release drugs from thermosensitive liposomal carriers. These drugs can include chemotherapies such as doxorubicin, for which targeted release is desired due to the dose-limiting systemic side effects, namely cardiotoxicity. Doxorubicin is a mainstay for treating a variety of malignant tumors and is commonly used in relapsed or recurrent rhabdomyosarcoma (RMS). RMS is the most common solid soft tissue extracranial tumor in children and young adults. Despite aggressive, multimodal therapy, RMS survival rates have remained the same for the past 30 years. To explore a solution for addressing this unmet need, an experimental protocol was developed to evaluate the release of thermosensitive liposomal doxorubicin (TLD) in an immunocompetent, syngeneic RMS mouse model using MRgHIFU as the source of hyperthermia for drug release.

Presented here is a protocol to use controlled hyperthermia, generated by magnetic resonance-guided high intensity focused ultrasound, to trigger drug release from temperature-sensitive liposomes in a rhabdomyosarcoma mouse model.

Magnetresonanzgesteuerte, hochintensive, fokussierte, ultraschallerzeugte Hyperthermie: eine praktikable Behandlungsmethode in einem murinen Rhabdomyosarkommodell

Magnetic resonance-guided high intensity focused ultrasound (MRgHIFU) is an established method for producing localized hyperthermia. Given the real-time ...

Krebsforschung

<meta charset="utf8"></head><body>Nanodrug, das auf onkogene miRNA-10b zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs abzielt

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

<meta charset="utf8"></head><body>Eisenoxid-Nanopartikel für die bildgestützte Therapieverabreichung beim murinen Glioblastom

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Innovative Krebstherapien mit Eisenoxid-Nanopartikeln zur Behandlung von Glioblastomen

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem

Zusammenfassung

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Ex vivo-Kultur der Patient Tissue & Prüfung von Gentransfer

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Magnetresonanzgesteuerte, hochintensive, fokussierte, ultraschallerzeugte Hyperthermie: eine praktikable Behandlungsmethode in einem murinen Rhabdomyosarkommodell

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell