Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Fläche, des Umfangs und der Form der intrazellulären Struktur aus seinem zweidimensionalen Bild. Diese Technik ist schnell und einfach, erfordert nur Standard-Laboreinstellungen und ein konfokales Mikroskop und verwendet Open-Source-Software. Demonstriert wird das Verfahren von Anna Balcerak, einer Doktorandin aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Aussaat viermal 10 bis fünf Zellen in 0,5 Milliliter Kulturmedium pro Brunnen in einem vier-Well-Kollagen-ein beschichteten Kammerschlitten für eine 24-Stunden-Kultur in einem 37 Grad Celsius und fünf Grad Kohlendioxid-Inkubator. Verwenden Sie am nächsten Morgen ein optisches invertiertes Mikroskop, um das Vorhandensein einer mindestens 90%konfluenten Monoschicht zu überprüfen, und verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um einzelne Z-Slice-Bilder zu erhalten. Öffnen Sie für die Fokushaftungsanalyse die Bilder in ImageJ, und wählen Sie Analysieren, Festlegen von Skalierung, Entfernungsskala und Global auswählen, um die Bildskala in Pixel n. Chr. festzulegen.
Um den Dateinamen und den Bereich des Interessenbereichs in die Messoptionen einzubeziehen, klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen, und überprüfen Sie die Bereichs- und Anzeigebeschriftungsoptionen. Um den Hintergrund zu subtrahieren, wählen Sie Prozess aus und subtrahieren Sie den Hintergrund. Stellen Sie den Rollenkugelradius auf 50 Pixel ein und überprüfen Sie das Gleitparaboloid.
Um die Fläche der kleinsten Interessensregion zu bestimmen, skizzieren Sie die kleinste einzelne fokussokale Haftung, und klicken Sie auf Analysieren und Messen, um die Fläche zu messen. Wenn mindestens 20 Interessengebiete ausgewählt und gemessen wurden, berechnen und speichern Sie den Mittelwert der erzielten Ergebnisse. Legen Sie die obere Grenze auf 25 % eines typischen Zellenbereichs fest.
Um das Bild binär zu verleihen, klicken Sie auf Bild, Anpassen und Schwellenwert, und aktivieren Sie Standard, Schwarzweiß und dunklen Hintergrund. Um die Anzahl und die Flächen der Interessengebiete zu messen, wählen Sie Partikel analysieren und analysieren und Pixeleinheiten überprüfen, Ergebnisse anzeigen, Ergebnisse löschen und zusammenfassen. Übertragen Sie die Daten der Segment-, Zähl- und Gesamtflächendurchschnittsgröße aus dem Zusammenfassungsfenster in das Datenverwaltungsprogramm Ihrer Wahl.
Für die fokale Haftungsquantifizierung öffnen Sie das fokale Adhäsions-ImageJ-Makro und geben Sie den Bereich der kleinsten Interessenregion als Bereich des kleinsten Bereichs von Interesse ein. Legen Sie den Schwellenwerttypwert auf manuell oder automatisch fest, und speichern Sie die Änderungen. Rufen Sie dann das Makro von ImageJ auf, und wählen Sie das zu verarbeitende Bild aus.
Öffnen Sie für die manuelle Zellformanalyse ein Bild in einem entsprechenden Bildverarbeitungssoftwareprogramm, und wählen Sie die zu messenden Parameter aus. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um die Zellränder manuell zu abgrenzen, wie sie durch die Knotenproteine Ihrer Wahl gekennzeichnet sind. Die ausgewählten Parameter werden automatisch für jede Zelle berechnet.
Wenn alle Zellen umrissen wurden, wählen Sie Bearbeiten, Auswählen und Hinzufügen zum Manager aus. Es sollten nur vollständige vollständig sichtbare Zellen mit ununterbrochenen Rahmen ausgewählt werden. Um die Messung durchzuführen, markieren Sie alle Zahlen, die im linken Feld des Bereichs des Interessenmanagers angezeigt werden, und klicken Sie auf Maß.
Die Ergebnisse werden im Ergebnisfeld angezeigt und können in die Kalkulationstabelle ihrer Wahl importiert werden. Die automatisierte Zellanalyse erleichtert die Quantifizierung der großen Anzahl von Zellen. Führen Sie für jeden neuen Zelltyp zuerst das Makro aus, um Parameter festzulegen.
Wenn das Makro fertig ist, wählen Sie Zellengrößengrenzen festlegen aus. Klicken Sie auf die Beschriftung der kleinsten und größten Zellen, und klicken Sie auf Maß. Legen Sie den Wert der kleinsten Zelle und der größten Zellvariablen fest, und speichern Sie die Änderungen.
Schließen Sie alle Makrofenster, und wählen Sie das Bild aus, das in Graustufen verarbeitet werden soll. Führen Sie dann das Makro erneut aus. Das Makro stellt eine Tabelle der Ergebnisse bereit, die den Zellformindex, das Seitenverhältnis und die Listendaten der Interessensauswahl umfasst.
Hier können repräsentative Bilder von Brennadesionen, die mit ImageJ gezählt werden, einschließlich der endgültigen nummerierten Umrisse und der Überlagerungen der Fokushaftungsumrisse mit dem Originalbild sowohl für die Steuer- als auch für die Knockdown-Zelllinien beobachtet werden. Wie in dieser Analyse dargestellt, zeigten die Knockdown-Zellen eine höhere Anzahl von Adhäsionen pro Zelle sowie Adhäsionen, die größer sind als Kontrollzellen. In diesen Bildern werden repräsentative Regionen unbehandelter und chemotherapeutisch behandelter Zellmonolayer dargestellt.
Die Umrisszellen wurden entsprechend ihren Zellformindexwerten charakterisiert, z. B. in dieser Analyse, die eine Zunahme des letzten Behälters und eine Abflachung der Hauptspitzen für die medikamentös behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zeigt. Für jede Zellkultur kann dann eine Frequenzverteilung und eine kumulative Verteilung generiert werden. Die Graustufenbildgebung der Monolayer, wie gezeigt, ermöglichte die Analyse und Quantifizierung von 512 Zellen aus 12 Sichtfeldern, die eine relative Frequenzverteilung des Zellformindex aufzeigten.
Damit dieses Protokoll funktioniert, ist es wichtig, Bilder von der bestmöglichen Qualität zu verwenden. Die richtige Zellaussaat, Färbung und Bildgebung sollte Bilder von ausreichender experimenteller Qualität gewährleisten.
