Die Autoren danken Herrn Ray Lee, Herrn HC Leung und Mr. Wallace So für ihre freundliche Unterstützung bei der Herstellung der Lichtquelle und des Pulverinsufflators; und die Fakultät senkernde Einrichtung für die Unterstützung bei der Tierbildgebung. Die Arbeit wurde vom Research Grant Council, Hong Kong (17300319) unterstützt.

Die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden vom Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), der University of Hong Kong, genehmigt. Trockenpulverformulierungen, die durch Sprühgefriertrocknung (SFD) hergestellt werden und 0,5% der Luziferase-Boten-RNA (mRNA), 5% synthetisches Peptid PEG12KL4 und 94,5% Mannitol (w/w) enthalten, werden in dieser Studie verwendet, um die mRNA-Expression in der Lunge zu demonstrieren16. Der mittlere Aerodynamikdurchmesser (MMAD) des SFD-Pulvers beträgt 2,4 m. Sprühgetrocknetes (SD) Mannitolpulver wird verwendet, um die Wirkung des Luftvolumens in pulverdispersion16zu untersuchen. Der MMAD aus SD-Pulver ist 1,5 m.
1. Herstellung von Trockenpulver-Insufflator und Beladung von trockenem Pulver
<ol><li>(Optional) Neutralisieren Sie die statischen Ladungen von trockenem Pulver (in einer Durchstechflasche) und der 200 L Non-Filter-Rund-Gel-Ladepipettenspitze. Verwenden Sie eine antistatische Pistole oder ein Gleichgewicht mit Deionisierungsfunktion gemäß der Anweisung des Herstellers.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Wägepapier mit einer Größe von ca. 4 cm x 4 cm vor. Falten Sie das Papier in der Hälfte diagonal und dann entfalten.</li>
	<li>Wiegen Sie 1-2 mg trockenes Pulver auf dem Wägepapier.</li>
	<li>Füllen Sie eine Gel-Lade-Pipettenspitze mit Pulver durch die breitere Öffnung der Spitze. Tippen Sie vorsichtig, um das Pulver zu verpacken, bis das Pulver lose Agglomerate in der Nähe des schmalen Endes der Spitze bildet (Abbildung 1A). Vermeiden Sie das Verpacken des Pulvers zu eng, da es die Pulverdispersion behindern kann.</li>
	<li>Schließen Sie die pulverbelastete Spitze über einen Dreiwege-Stoppcock an eine 1 ml Spritze an (Abbildung 1B). Die Größe der Spritze kann entsprechend dem Volumen der Luft geändert werden, die verwendet wird, um das Pulver zu dispergieren. Halten Sie die Spitze und Spritze während des Anschlusses vertikal, um das Auslaufen von Pulver zu verhindern. Wenn die Verabreichung nicht sofort durchgeführt wird, verwenden Sie Parafilm, um die Öffnungen der Spitze zu versiegeln und vorübergehend unter geeigneten Bedingungen bis zur Verabreichung aufzubewahren.</li>
</ol>2. Herstellung von Intubationsvorrichtung
<ol><li>Lichtquelle (Abbildung 2)<ol>
<li>Bereiten Sie eine maßgeschneiderte Lichtquelle mit einem Leuchtdiodenbrenner (LED) und einer flexiblen Optischen Faser mit einem Durchmesser von 0,8-1 mm vor.</li>
		<li>Machen Sie eine zentrierte Öffnung auf der klaren Linse des LED-Brenners mit einem Handbohrer oder einem Bohrer, so dass die Glasfaser kaum passieren kann.</li>
		<li>Legen Sie die Glasfaser durch die Öffnung. Schalten Sie den LED-Brenner ein, um die Position und die Einfügetiefe für maximale Helligkeit am anderen Ende der Glasfaser einzustellen.</li>
		<li>Befestigen Sie die Glasfaser in Position mit klarem Epoxidkleber.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führungskanüle (Abbildung 3)<ol>
<li>Nehmen Sie eine 1 ml Kunststoff Pasteur Pipette (Abbildung 3A) und halten Sie die Pipette an beiden Enden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Alkohollampe (oder andere Wärmequellen im Labor wie einen Bunsenbrenner), um die Mitte der Pipette zu erhitzen, indem Sie sie bei 5-10 cm über der Flamme platzieren(Abbildung 3B). Drehen Sie die Pipette, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig erhitzt wird.</li>
		<li>Wenn der Kunststoff weich und verformbar wird, bewegen Sie die Pipette von der Flamme weg und dehnen Sie die Pipette sanft.</li>
		<li>Schneiden Sie die gestreckte Pipette in der Mitte mit einer Schere in Teil A und Teil B (Abbildung 3C-E). Verwenden Sie Teil A als Feinspitzenpipette und Teil B als Führungskanüle. Um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation mit der Führungskanüle zu erhöhen, machen Sie eine Abschrägung (nicht zu scharf, die das Risiko der Verletzung des Tieres erhöhen kann) am Ende von Teil B (Abbildung 3F). Wenn eine 200 L L Gel-Ladepipettenspitze (für Pulverbelastung) in die Führungskanüle eingesetzt wird, sollte sie um 1-2 mm in die Kanüle ragen. HINWEIS: Eine Führungskanüle (Teil B) mit der entsprechenden Dimension (Innen- und Außendurchmesser) für die Intubation könnte eine 21-Spur-Nadel in sie passen, während sie auch in eine 17-Spur-Nadel passen kann. Es können mehrere Versuche erforderlich sein, um die Pipetten zu dehnen, um die entsprechende Dimension zu erreichen.</li>
		<li>(Optional): Schneiden Sie eine kleine Öffnung am breiteren Ende der Führungskanüle, um sie flexibler zu machen, so dass es einfacher ist, die Glasfaser zu halten (Abbildung 3F). Diese Öffnung ermöglicht auch den Einbau eines Mikrosprühers für die Verabreichung von flüssigem Aerosol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Intubation
<ol><li>Anästhesisieren Sie die Maus (BALB/c, 7-9 Wochen) mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Plattform aus Plexiglas vor und montieren Sie sie mit einer Klemme an einen Ständer (Abbildung 4A). Platzieren Sie die anästhesierte Maus auf der Plattform (bei etwa 60° Neigung) in einer Supine-Position. Die Höhe und der Neigungswinkel der Plattform konnten durch die Position der Klemme auf dem Ständer eingestellt werden.</li>
	<li>Halten Sie die Maus an, indem Sie ihre Schneidezähne an eine Nylonseide hängen (Abbildung 4B). Sichern Sie die Position der Maus durch ein Stück Klebeband oder ein Gummiband.</li>
	<li>Setzen Sie die optische Faser vor der Intubation mit der Spitze des Faserniveaus mit der Öffnung der Führungskanüle in die Führungskanüle ein. Schalten Sie den LED-Brenner ein, um zu leuchten.</li>
	<li>Schieben Sie die Zunge der Maus vorsichtig mit einem Paar Zangen hervor, um ihre Luftröhre freizulegen.</li>
	<li>Verwenden Sie die andere Hand, um die Führungskanüle mit Glasfaser innen zu halten. Legen Sie sie durch die Mundhöhle. Mit der Beleuchtung aus der Optischen Faser kann die Öffnung der Luftröhre als Öffnung zwischen den Stimmbändern visualisiert werden.</li>
	<li>Richten Sie die Abschrägung der Führungskanüle auf die Mittellinie der Öffnung aus (Abbildung 5A). Intubieren Sie die Führungskanüle mit Glasfaser sanft in die Luftröhre, indem Sie die feinste Spitze der Kanüle auf die Luftröhreeinltenöffnung zielen.</li>
	<li>Bei der Intubation die optische Faser schnell entfernen und die Führungskanüle in der Luftröhre lassen (Abbildung 5B). Eine normale Atmung sollte beobachtet werden.</li>
	<li>Halten Sie die feine Spitzenpipette (Teil A) beim Öffnen der Führungskanüle und insuffieren Sie einen kleinen Luftwirbel (ca. 0,2 ml) in die Lunge der Maus. Eine leichte Inflation in der Brust der Maus weist auf eine richtige Intubation hin. Entfernen Sie die Feinspitze Pipette vor der Pulververabreichung.</li>
</ol>4. Pulververwaltung
<ol><li>Halten Sie die pulverbelastete Spitze, die mit der Spritze verbunden ist, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass der Luftstrom zwischen der Spritze und der Spitze getrennt ist.</li>
	<li>Ziehen Sie den Spritzenkolben nach hinten, um 0,6 ml Luft zurückzuziehen. HINWEIS: Das Volumen der Luft, die verwendet wird, um das Pulver zu dispergieren, hängt von den Eigenschaften des Pulvers und der Menge des geladenen Pulvers ab. Dies wird im Ergebnisabschnitt weiter beschrieben.</li>
	<li>Drehen Sie das Ventil des Drei-Wege-Stopphahns, um den Luftstrom zwischen der Spritze und der pulverbelasteten Spitze zu verbinden.</li>
	<li>Setzen Sie die pulverbelastete Spitze in die Führungskanüle ein, die bereits in die Luftröhre der Maus gelegt wurde (Abbildung 5C). Halten Sie die Führungskanüle und drücken Sie den Spritzenkolben in einer kontinuierlichen Aktion, um das Pulver als Aerosole in die Lunge zu zerstreuen. HINWEIS: Jede Vorwärtsbewegung des Geräts sollte minimiert werden, um eine Verletzung des Tieres zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Spitze und überprüfen Sie, ob das Pulver in der Spitze geleert wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie Schritt 4.1 bis 4.4. HINWEIS: Wenn das Pulver aufgrund übermäßigen Abklopfens zu fest verpackt ist, wird es möglicherweise nicht richtig dispergiert.</li>
	<li>Sobald die Verabreichung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Führungskanüle aus der Luftröhre.</li>
	<li>Lassen Sie die Maus sich erholen, indem Sie sie horizontal in einer Supine-Position positionieren, wobei die Zunge halb hervorsteht, um die Blockade der Atemwege zu vermeiden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Newman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+the+lungs:+challenges+and+opportunities.">Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities.</a> Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).</li><li>Setter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+dry+powder+insulin+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus.">Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus.</a> Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).</li><li>Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aerosol+generator+for+homogenous+distribution+of+powder+over+the+lungs+after+pulmonary+administration+to+small+laboratory+animals.">A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+the+DP-4M+PennCentury+insufflator.">In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).</li><li>Liao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+highly+dispersible+voriconazole+dry+powders+produced+by+spray+freeze+drying+for+pulmonary+delivery+with+efficient+lung+deposition.">Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition.</a> International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).</li><li>Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+pDNA+Inhalation+Powder+Composed+of+Hyaluronic+Acid+Exhibits+High+Gene+Expression+in+the+Lungs.">Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).</li><li>Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+simple+device+for+insufflation+of+dry+powders+in+a+mice+model.">Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In diesem Papier werden maßgeschneiderte Geräte zur Trockenpulverinsufflation und intratrachealen Intubation vorgestellt. Im Pulverladeschritt wird Trockenpulver in eine 200-L-Gel-Ladepipettenspitze geladen. Es ist wichtig, vorsichtig auf die Spitze zu tippen, um die lose Verpackung von Pulver am schmalen Ende der Spitze zu ermöglichen. Wenn das Pulver jedoch zu fest verpackt ist, bleiben sie in der Spitze stecken und können nicht richtig dispergiert werden. Es wird empfohlen, die statischen Aufladungen des Pulvers u...

Der lungene Verabreichungsweg bietet verschiedene Vorteile bei der Bereitstellung von Therapeutika für lokale und systemische Maßnahmen. Für die Behandlung von Lungenerkrankungen kann eine hohe lokale Medikamentenkonzentration durch Lungenabgabe erreicht werden, wodurch die erforderliche Dosis reduziert und die Inzidenz systemischer Nebenwirkungen verringert wird. Darüber hinaus können die relativ geringen enzymatischen Aktivitäten in der Lunge den vorzeitigen Arzneimittelstoffwechsel reduzieren. Die Lunge ist auch effizient für die Arzneimittelabsorption für systemische Wirkung aufgrund der großen und gut durchfundierten Oberfläche, der extrem dünnen Epithelzellschicht und des hohen Blutvolumens in Lungenkapillaren1.
Inhalierte Trockenpulverformulierungen wurden umfassend für die Prävention und Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Diabetes mellitus und Lungenimpfung2,3,4untersucht. Medikamente im festen Zustand sind in der Regel stabiler als in der flüssigen Form, und trockene Pulverinhalatoren sind tragbarer und benutzerfreundlicher als Vernebler5,6. Bei der Entwicklung von inhalierten Trockenpulverformulierungen müssen die Sicherheit, das pharmakokinetische Profil und die therapeutische Wirksamkeit in präklinischen Tiermodellen nach lungenerVerabreichung7 bewertet werden. Im Gegensatz zu Menschen, die trockenes Pulver aktiv einatmen können, ist die Lungenabgabe von trockenem Pulver an Kleintiere eine Herausforderung. Es ist notwendig, ein effizientes Protokoll für die Lieferung von trockenem Pulver an die Lunge von Tieren zu erstellen.
Mäuse sind weit verbreitet als Forschungstiermodelle verwendet, weil sie wirtschaftlich sind und sie gut brüten. Sie sind auch einfach zu handhaben und viele Krankheitsmodelle sind gut etabliert. Es gibt zwei Hauptansätze, um trockenes Pulver an die Lunge der Maus zu verabreichen: Inhalation und intratracheale Verabreichung. Zum Einatmen wird die Maus in eine Ganzkörper- oder Nasenkammer gelegt, in der trockenes Pulver aerosolisiert wird und die Tiere das Aerosol ohne Sedierung8,9einatmen. Teure Ausrüstung ist erforderlich und die Wirksamkeit der Medikamentenabgabe ist gering. Während die Ganzkörperkammer technisch weniger anspruchsvoll sein kann, könnte die Nasen-Expositionskammer die Exposition von Medikamenten an der Körperoberfläche minimieren. Unabhängig davon ist es immer noch schwierig, die an die Lunge abgegebene Dosis genau zu kontrollieren und zu bestimmen. Das trockene Pulver wird hauptsächlich in der Nasopharynx-Region abgelagert, wo die Mukociliaary Clearance prominentist 10. Darüber hinaus sind Mäuse in der Kammer während des Verabreichungsprozesses unter erheblichem Stress, weil sie eingeschränkt und der Nahrungs- und Wasserversorgung beraubt sind11. Für die intratracheale Verabreichung bezieht es sich in der Regel auf die Einführung des Stoffes direkt in die Luftröhre. Es gibt zwei verschiedene Techniken, um dies zu erreichen: Tracheotomie und orotracheale Intubation. Ersteres erfordert einen chirurgischen Eingriff, der einen Schnitt in der Luftröhre macht, die invasiv ist und selten für die Pulververabreichung verwendet wird. Hier wird nur die zweite Technik beschrieben. Im Vergleich zur Inhalationsmethode ist die intratracheale Verabreichung die am häufigsten verwendete Methode zur Lungenabgabe in der Maus wegen ihrer hohen Liefereffizienz bei minimalem Medikamentenverlust12,13. Es ist eine einfache und schnelle Methode, um eine kleine Menge Pulver innerhalb weniger Milligramm genau an die Maus zu liefern. Obwohl die Maus anatomisch und physiologisch für den Menschen unterscheidet und während des Intubationsprozesses eine Anästhesisierung erforderlich ist, umgeht die intratracheale Verabreichung die oberen Atemwege und bietet eine effektivere Möglichkeit, die biologischen Aktivitäten der Trockenpulverformulierung wie Lungenabsorption, Bioverfügbarkeit und therapeutische Wirkungen14,15zu bewerten.
Um trockenes Pulver intratracheal zu verabreichen, muss die Maus intubiert werden, was eine Herausforderung sein könnte. In diesem Papier wird die Herstellung eines maßgeschneiderten Trockenpulverinsufflators und einer Intubationsvorrichtung beschrieben. Die Verfahren der Intubation und Insufflation von trockenem Pulver in der Lunge der Maus werden demonstriert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/c mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap Firefly Luciferase mRNA</td>
			<td>TriLink Biotechnology</td>
			<td>L-7602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Powder Insufflator</td>
			<td>PennCentury</td>
			<td>Model DP-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>Alfasan International B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode (LED) torch</td>
			<td>Unilite Internation</td>
			<td>PS-K1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol (Pearlitol 160C)</td>
			<td>Roquette</td>
			<td>450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-filter round gel loading pipette tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1034-800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon floss</td>
			<td>Reach</td>
			<td>30017050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One milliliter syringe without needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fibre</td>
			<td>Fibre Data</td>
			<td>OMPF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG12KL4 peptide</td>
			<td>EZ Biolab</td>
			<td></td>
			<td>(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur fine tip pipette</td>
			<td>Alpha Labotatories</td>
			<td>LW4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>Braun</td>
			<td>D201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Alfasan International B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td>MILTY</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal administration of dry powder formulation in mice

Bei der Entwicklung von inhalierbaren Trockenpulverformulierungen ist es wichtig, ihre biologischen Aktivitäten in präklinischen Tiermodellen zu bewerten. Dieses Papier führt eine nichtinvasive Methode der intratrachealen Abgabe von Trockenpulverformulierung bei Mäusen ein. Präsentiert wird eine trockene Pulverladevorrichtung, die aus einer 200 l L Gel-Ladepipettenspitze besteht, die über einen Dreiwege-Stopphahn mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Eine kleine Menge Trockenpulver (1-2 mg) wird in die Pipettenspitze geladen und mit 0,6 ml Luft in der Spritze dispergiert. Da Pipettenspitzen Einweg- und Preisprodukte sind, können verschiedene Trockenpulverformulierungen im Voraus in verschiedene Spitzen geladen werden. Verschiedene Formulierungen können im selben Tierexperiment ohne Gerätereinigung und Dosisnachfüllen bewertet werden, wodurch Zeit gespart und das Risiko einer Kreuzkontamination durch Restpulver vermieden wird. Das Ausmaß der Pulverdispersion kann anhand der Inderintauchmenge in der Pipettenspitze untersucht werden. Ein Protokoll der Intubation in der Maus mit einer maßgeschneiderten Lichtquelle und einer Führungskanüle ist enthalten. Die richtige Intubation ist einer der Schlüsselfaktoren, die die intratracheale Abgabe von Trockenpulverformulierung entoltal entherin in den tiefen Lungenbereich der Maus beeinflussen.

Wenn ein Trockenpulver-Insufflator verwendet wird, um Pulveraerosol in die Lunge eines Tieres zu liefern, ist das verwendete Luftvolumen entscheidend, da es sowohl die Sicherheit als auch die Pulverdispersionseffizienz beeinflusst. Zur Optimierung der Methode wurden verschiedene Luftmengen (0,3 ml, 0,6 ml und 1,0 ml) verwendet, um das Trockenepulver (1 mg sprühgetrocknetes Mannitol) zu dispergieren, und das Gewicht von Mäusen wurde 48 Stunden nach der Verabreichung überwacht(Abbildung 6)....

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Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

Trockenpulverformulierungen zur Inhalation haben ein großes Potenzial bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen. Vor dem Eintritt in Studien am Menschen ist es notwendig, die Wirksamkeit der Trockenpulverformulierung in präklinischen Studien zu bewerten. Eine einfache und nichtinvasive Methode zur Verabreichung von Trockenpulver bei Mäusen über den intratrachealen Weg wird vorgestellt.

Intratrachealadministration der Trockenpulverformulierung bei Mäusen

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Aufrufe.  The University of Hong Kong. Trockenpulverformulierungen zur Inhalation haben ein großes Potenzial bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen. Vor dem Eintritt in Studien am Menschen ist es notwendig, die Wirksamkeit der Trockenpulverformulierung in präklinischen Studien zu bewerten. Eine einfache und nichtinvasive Methode zur Verabreichung von Trockenpulver bei Mäusen über den intratrachealen Weg wird vorgestellt.

Serie: Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Forschung

Medizin

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Intranasale Verabreichung von CNS Therapeutics Awake Mäuse

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and bronchodilator drugs. Despite the availability of multiple treatments, both diseases are growing public health concerns. The majority of asthma patients are well controlled on current inhaled therapies but a substantial number of patients with severe asthma are not. Asthma affects an estimated 300 million people worldwide and approximately 20 percent have a severe form of the disease. In contrast to asthma, there are few effective therapies for COPD. An estimated 10% of the population has COPD and the trend in death rates is increasing for COPD while decreasing for other major diseases. Although developing drugs for inhaled delivery is challenging, the nose-only inhalation unit enables direct delivery of novel drugs to the lung of rodents for pre-clinical efficacy and safety/toxicology studies. Inhaled drug delivery has multiple advantages for respiratory diseases, where high concentration in the lung improves efficacy and minimizes systemic side effects. Inhaled corticosteroids and bronchodilators benefit from these advantages and inhaled delivery may also hold potential for future biologic therapies. The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs of rodents, key data required before initiating clinical development.

The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs; key data enabling clinical inhaled drug development.

Trockenpulver und Vernebelte Aerosol Inhalation von Arzneimitteln geliefert an Mäusen Mit einem Nose-only Belichtungssystem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study these pulmonary diseases. Previous pleural effusion models paid more attention to biological factors rather than nanoparticles in the environment. Here, we introduce a model to make pleural effusion in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica, and a method of nanoparticle isolation in the pleural effusion. By intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica with concentrations of 3.125, 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL, the pleural effusion in rats presented on day 3, peaked at days 7-10 in 6.25 and 12.5 mg/kg&#8729;mL groups, then slowly decreased and disappeared on day 14. When the concentration of polyacrylate/nanosilica increased, the pleural effusion is produced more and faster. This pleural fluid was detected by ultrasound examination or CT chest scanning and confirmed by dissection of rats. Silica nanoparticles were observed in the rats' pleural effusion by transmission electron microscope. These results showed that the exposure to polyacrylate/nanosilica leads to the induction of pleural effusion, which was consistent with our previous report in humans. Additionally, this model is beneficial for the further study of nanotoxicology and the pleural effusion diseases.

Here, we present a protocol to construct a pleural effusion model in rats by intratracheal instillation of polyacrylate/nanosilica.

Ein Pleuraerguss Modell bei Ratten durch intratracheale Instillation von Polyacrylat/Nanosilica

Pleural effusion is a prevalent clinical finding of many pulmonary diseases. Having a useful animal pleural effusion model is very important to study ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Etablierung eines schweren Trockenauges modell mit vollständiger Dakryoadenektomie bei Kaninchen

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia (BPD). In premature infants, BPD is a major complication despite early use of surfactant therapy, optimal ventilation strategies, and noninvasive positive pressure ventilation. Because pulmonary inflammation plays a crucial role in the pathogenesis of BPD, corticosteroid use is one potential treatment to prevent it. Nevertheless, systemic corticosteroid treatment is not usually recommended for preterm infants due to long-term adverse effects. Preclinical studies and human phase I clinical trials demonstrated that use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in hyperoxia-induced lung injuries and in preterm infants is safe and feasible. Intratracheal and intravenous MSC transplantation has been shown to protect against neonatal hyperoxic lung injury. Therefore, intratracheal administration of stem cells and combined surfactant and glucocorticoid treatment has emerged as a new strategy to treat newborns with respiratory disorders. The developmental stage of rat lungs at birth is equivalent to that in human lungs at 26&#8722;28 week of gestation. Hence, newborn rats are appropriate for studying intratracheal administration to preterm infants with respiratory distress to evaluate its efficacy. This intratracheal instillation technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into the lungs.

Described is a protocol for performing intratracheal transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) through intratracheal injection in term neonatal rats. This technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into neonatal rat lungs to evaluate their efficacy.

Intratracheale Instillation von Stammzellen bei Term Neonatal Ratten

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered drug. This has direct translational impact because surfactant and drugs are administered locally into the lungs. Though the literature has many publications describing minimally invasive transoral intubation of adult mice and rats in therapeutic experiments, this approach in neonatal rat pups is lacking. The small size of orotracheal region/pharynx in the pups makes visualization of laryngeal lumen (vocal cords) difficult, contributing to the variable success rate of intratracheal drug delivery. We hereby demonstrate effective oral intubation of neonatal rat pup - a technique that is non-traumatic and minimally-invasive, so that it can be used for serial administration of drugs. We used an operating otoscope with an illumination system and a magnifying lens to visualize the tracheal opening of the rat neonates. The drug is then instilled using a 1 mL syringe connected to a pipette tip. The accuracy of the delivery method was demonstrated using Evans blue dye administration. This method is easy to get trained in and could serve as an effective way to instill drugs into trachea. This method could also be used for administration of inoculum or agents to simulate disease conditions in animals and, also, for cell-based treatment strategies for various lung diseases.

This technique of instilling drugs directly into the trachea of neonatal rodents is important in studying the impact of locally administered drugs or biologicals on neonatal lung diseases. Additionally, this method can also be used for inducing lung injury in animal models.

Eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Instillation von Medikamenten bei neonatalen Nagetieren zur Behandlung von Lungenerkrankungen

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Customizable Disposable Dosators to Deliver Dry Powder Aerosol Drugs to Mice

Disposable Dosators Intended for Dry Powder Delivery to Mice

Dry powder inhalers offer numerous advantages for delivering drugs to the lungs, including stable solid-state drug formulations, device portability, bolus metering and dosing, and a propellant-free dispersal mechanism. To develop pharmaceutical dry powder aerosol products, robust in vivo testing is essential. Typically, initial studies involve using a murine model for preliminary evaluation before conducting formal studies in larger animal species. However, a significant limitation in this approach is the lack of suitable device technology to accurately and reproducibly deliver dry powders to small animals, hindering such models&#39; utility. To address these challenges, disposable syringe dosators were developed specifically for intrapulmonary delivery of dry powders in doses appropriate for mice. These dosators load and deliver a predetermined amount of powder obtained from a uniform bulk density powder bed. This discrete control is achieved by inserting a blunt needle to a fixed depth (tamping) into the powder bed, removing a fixed quantity each time. Notably, this dosing pattern has proven effective for a range of spray-dried powders. In experiments involving four different model spray-dried powders, the dosators demonstrated the ability to achieve doses within the range of 30 to 1100 &#181;g. The achieved dose was influenced by factors such as the number of tamps, the size of the dosator needle, and the specific formulation used. One of the key benefits of these dosators is their ease of manufacturing, making them accessible and cost-effective for delivering dry powders to mice during initial proof-of-concept studies. The disposable nature of the dosators facilitates use in animal procedure rooms, where cleaning and refilling reusable systems and weighing materials is inconvenient. Thus, developing disposable syringe dosators has addressed a significant hurdle in murine dry powder delivery for proof-of-concept studies, enabling researchers to conduct more accurate and reproducible preliminary studies in small animal models for pulmonary drug delivery.

Author Spotlight: Developing a Disposable Dosator for Preclinical Testing of Dry Powder Inhalers in Small Animal Models 

Pharmaceutical dry powder development necessitates reliable in vivo testing, often using a murine model. Device technology for accurately and reproducibly delivering dry powder aerosols to mice is restricted. This study presents disposable dosators for pulmonary drug delivery at mouse-relevant doses, aiding initial proof-of-concept research.

Einweg-Dosierer für die Verabreichung von Trockenpulver an Mäuse

Dry powder inhalers offer numerous advantages for delivering drugs to the lungs, including stable solid-state drug formulations, device portability, bolus ...