Dieses Protokoll zeigt, dass es möglich ist, Forschungsmaterial in die Luftröhre von fünf Tage alten neonatalen Rattenwelpen durch direkte Visualisierung einzuflößen. Diese Methode verbessert die Zuverlässigkeit der Verabreichung von Forschungsmaterial oder Medikament in die Luftröhre durch direkte Visualisierung. Durch die Vermeidung der Injektion in die Luftröhre reduziert diese Methode Schmerzen und, was noch wichtiger ist, Blutungen in die Luftröhre, was ein verbessertes Überleben ermöglicht.
Die Entwicklung von feinen Fähigkeiten ist erforderlich, um dieses Protokoll durchzuführen, einschließlich der angemessenen Positionierung des Tieres, der korrekten Verwendung des Operationsautoskops zur Visualisierung der Stimmbänder und der Wirksamkeit der Verabreichung in die Lunge. Das Verfahren wird von Tara Sudhadevi, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, und Alison Ha, einer Doktorandin, demonstriert. Bestätigen Sie vor Beginn des Experiments einen Verlust des Schwanz- und Pedalreflexes bei einem betäubten fünf Tage alten Rattenwelpen und verwenden Sie Laboretikettierband, um den Welpen in Rückenlage auf einer flachen, um 45 Grad geneigten Plattform zurückzuhalten.
Verwenden Sie stumpfe Pinzetten, um die Zunge sanft zur Seite zu ziehen, und halten Sie die Zunge mit Hilfe eines Otoskopspekulums mit einem Durchmesser von zwei Millimetern vorsichtig an Ort und Stelle, so dass der Kehlkopf sichtbar ist. Mit dem Operationsotoskop mit dem Spekulum in der richtigen Größe lokalisieren Sie die Stimmbänder durch die Lupe des Otoskops. Für die intratracheale Instillation laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer langwinkligen, gelbeladenen Pipettenspitze ausgestattet ist, mit 0,9 Kubikzentimetern Luft, gefolgt von 30 bis 50 Mikrolitern der interessierenden Substanz.
Biegen Sie die Pipettenspitze in einem Winkel von 30 Grad und führen Sie die geladene Pipettenspitze durch das Spekulum bis etwa zwei Millimeter über die Stimmbänder hinaus. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die interessierende Substanz und die Luft durch das Spekulum in die Stimmbänder zu verabreichen. Wenn die gesamte Substanz geliefert wurde, legen Sie den Welpen auf ein integriertes 38-Grad-Zirkulationsflüssigkeitsheizkissen mit Überwachung bis zur regelmäßigen Atmung, bevor Sie den Welpen wieder mit dem Damm vereinen.
Um die Verteilung der Substanz innerhalb einer Lungengewebeprobe zu bewerten, wischen Sie die Brust und den Bauch der eingeschläferten Rattenwelpen mit 70% Ethylalkohol ab und verwenden Sie eine sterile Technik, um die Lunge gemäß den Standardprotokollen für ihre visuelle Beurteilung zu entfernen. In dieser Studie wurde die Wirksamkeit der intratrachealen Instillationstechnik durch visuelle Untersuchung des Lungengewebes beurteilt, das von einem fünf Tage alten Rattenwelpen gesammelt wurde, der mit Evans blauem Farbstoff instilliert wurde. Die Instillation war fast 100% effizient, da sich der Farbstoff sofort nach der Verabreichung in die Lunge ausbreitete und sich über alle Lappen des Lungengewebes verteilte.
Der Farbstoff wurde in keinem Gewebe außerhalb der Lunge beobachtet, was die Fähigkeit der Technik bestätigt, für die selektive Verabreichung eines für die Lunge interessanten Therapeutikums verwendet zu werden. Das anfängliche Platzieren des Tieres im richtigen Winkel über eine feste Oberfläche ist entscheidend für den Erfolg des nächsten Schritts, die Stimmbänder mit dem Bedienautoskop zu visualisieren.
