Wir danken Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen und Anne Kankkunen für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands, der Päivikki and Sakari Sohlberg Foundation, der Tampere Tuberculosis Foundation, der Finnischen Medizinischen Stiftung, der Pirkanmaa Hospital District Research Foundation und dem Tampere University Hospital Research Fund finanziert.

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Finnischen Tierschutzkommission (Protokollnummer ESAVI/9520/2020 und ESAVI/6421/04.10.07/2017) genehmigt.
1. Versuchstiere und Maus OIR Modell Induktion
HINWEIS: Verwenden Sie zeitgepaarte Tiere, z. B. häufig verwendete C57BL/6J-Mäuse, um Welpen am selben Tag zur Welt zu bringen. Verwenden Sie Pflegedämme, z. B. 129 Stamm (129S1/SvImJ oder 129S3/SvIM) laktierende Dämme, um die Welpen während und nach der Induktion von Hyperoxia zu pflegen. Alternativ können Sie auch sicherstellen, dass zusätzliche laktierende Dämme zur Verfügung stehen, falls die Pflegedämme aufgrund von Erschöpfung ausgetauscht werden müssen. Beschränken Sie die Wurfgröße auf 6-7 Welpen für jeden Damm, wenn C57BL/6J Mäuse/Dams verwendet werden (wenn die Würfe größer sind als die Welpen tendenziell eine eingeschränkte Gewichtszunahme haben)16.
<ol><li>Zeichnen Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Hyperoxia-Induktion und zum Zeitpunkt des Opfers auf.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass es genügend Nahrung auf dem Boden des Käfigs gibt, damit die Dämme einen einfachen Zugang zu Nahrung haben.</li>
	<li>Fügen Sie Sodakalk mit Farbanzeige an der Unterseite der Kammer hinzu, um überschüssiges CO2 zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird.</li>
	<li>Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer und halten Sie die Luftfeuchtigkeit zwischen 40 und 65%. Erhöhen Sie die Feuchtigkeit der Kammer, wenn nötig, indem Sie Geschirr mit Wasser auf den Boden der Kammer (z.B. Petrischalen) legen.</li>
	<li>Kalibrieren Sie den O2-Sensor mit 100%O2 und normaler Raumluft.</li>
	<li>Legen Sie die P7-Mäuse in eine Kammer und richten Sie die O2-Ebene auf 75% ein. Halten Sie die Mäuse in der Kammer für 5 Tage, bis P12. Vermeiden Sie das Öffnen der Kammer während der Hyperoxia-Induktion. Überprüfen Sie den Gasdruck des O2-Zylinders und ersetzen Sie den Zylinder bei Bedarf. Überwachen Sie die Tiere während der Induktion.</li>
	<li>Nehmen Sie die Mauskäfige aus der Kammer und wiegen Sie alle Welpen. Gruppieren Sie die Welpen nach dem Gewicht, so dass jede Versuchsgruppe eine ähnliche Gewichtsverteilung in Welpen hat.</li>
</ol>2. Versuchstiere und Ratten-OIR-Modellinduktion (mit halbgeschlossenem System)
HINWEIS: Verwenden Sie zeitgebundene Tiere, um die Welpen am selben Tag zur Welt zu bringen. Verwenden Sie für Ratten-OIR eine erhöhte Wurfgröße von ca. 18 Welpen/Damm, um eine ausreichende NV-Induktion im Rattenmodell zu erhalten. Pool Welpen aus mehreren Würfen, um genügend Welpen zu jedem Wurf zu erhalten.
<ol><li>Zeichnen Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Induktion und zum Zeitpunkt des Opfers auf.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass es genügend Nahrung auf dem Boden des Käfigs gibt, damit die Dämme einen einfachen Zugang zu Nahrung haben.</li>
	<li>Fügen Sie Sodakalk mit Farbanzeige an der Unterseite der Kammer hinzu, um überschüssiges CO2 zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird.</li>
	<li>Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer. Absorbieren Sie zusätzliche Feuchtigkeit (erzeugt von mehreren Ratten) durch Zugabe von Kieselgel auf der Unterseite der Kammer.</li>
	<li>Kalibrieren Sie den O2-Sensor mit 100% N2 und normaler Raumluft.</li>
	<li>Legen Sie die Ratten in die Kammer bei P0 (wenige Stunden nach der Geburt). Stellen Sie den O2-Pegel auf 50% ein und schließen Sie den O2-Zylinder für 24 h an die Kammer an. Danach schalten Sie die Einstellungen auf 10% O2 und verbinden Stickstoff (N2) Zylinder mit der Kammer für 24 h. Fahren Sie 14 Tage lang mit dem 24-Stunden-Radverkehr zwischen 50% und 10% O2-Stufen fort.</li>
	<li>Überwachen Sie den Gasverbrauch und das Wohlbefinden der Tiere während der Studie. Öffnen Sie die Kammer während des Wechsels zwischen 50/10%O2 und fügen Sie bei Bedarf mehr Nahrung und Wasser hinzu. Ändern Sie die Käfige der Tiere, um sie während der Induktion zu reinigen.</li>
	<li>Nehmen Sie die Rattenkäfige aus der Kammer und wiegen Sie alle Welpen. Gruppieren Sie die Welpen nach dem Gewicht, so dass jede versuchsweise Gruppe eine ähnliche Gewichtsverteilung in den Welpen hat.</li>
</ol>3. Arzneimittelanwendung (optional)
HINWEIS: Häufig verwendete Arzneimittelverabreichungsroute in OIR erfolgt durch intravitreale Behandlung (ivt), bei P12-P14 für Mäuse und bei P14 für Ratten. Bestimmen Sie den Behandlungstag basierend auf dem Versuchsaufbau. Wenn mehrere Würfe von Welpen in Experimenten verwendet werden, teilen Sie die Behandlungsgruppen, um Tiere von allen Würfen zu haben. Vorzugsweise, injizieren Sie das Medikament auf nur ein Auge, und halten Sie das kontralaterale Auge als Kontrolle.
<ol><li>Wiegen Sie die Tiere und machen Sie Identifikationszeichen an Schwanz und/oder Ohr.</li>
	<li>Anästhesieren Sie das Tier entweder mit injizierbarer Anästhesie (z. B. Mischung aus Ketamin und Medetomidin, 30 mg/kg und 0,4 mg/kg für Mäuse) oder mit Inhalationsanästhesie (Isofluran bei 2-3,5% Isofluran und 200-350 ml/min Luftstrom). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen kneifen. Halten Sie das Tier während der Behandlung auf einem Heizkissen.</li>
	<li>Für lokalanästhesien, tragen Sie einen Tropfen Schmerzmittel auf das Augenlid. Öffnen Sie das Augenlid vorsichtig mit Zange, bevor Sie die ivt durchführen, wie Mäuse und Ratten öffnen ihre Augen um P14. Tragen Sie einen Tropfen Schmerzmittel (z. B. Oxybuprocainhydrochlorid) auf die Hornhaut auf.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen Jod auf, bevor Sie die ivt-Injektion durchführen.</li>
	<li>Für die ivt-Injektion eine Glasspritze mit einer 33-34 G Nadel verwenden. Drücken Sie die Augenlider nach unten und grasen Sie den Augapfel mit Zangen. Machen Sie die Injektion nachtränk an den Limbus, etwa in 45° Winkelnadel, die auf den Sehnerv zeigt.</li>
	<li>Vermeiden Sie es, mehr als 1,0 l in den intravitrealen Raum zu injizieren. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für 30 s nach der Injektion des Medikaments, um Reflux der injizierten Lösung zu vermeiden.</li>
	<li>Untersuchen Sie das Auge (z. B. mit einem Ophthalmoskop) auf Komplikationen wie Blutungen oder Netzhautschäden nach dem Entfernen der Nadel. Nach der Injektion antibiotikaische Salbe auf Hornhaut auftragen. HINWEIS: Das ivt-Injektionsvolumen für Mäuse sollte 0,5 – 1,0 l betragen.</li>
	<li>Umkehren Sie die Anästhesie (z.B. mit einem 2-Antagonisten für Medetomidin (2,5 mg/kg) und geben Sie den Welpen in den Käfig zurück. Den Müll normalerweise bis zum Ende der Studie unterbringen.</li>
</ol>4. In-vivo-Bildgebung und Elektroretinographie (optional)
<ol><li>Auf Wunsch führen Sie während der Nachbeobachtungszeit in vivo-Bildgebung an lebenden Tieren durch, um Veränderungen aufzuzeichnen, die sich in der Netzhaut während der angiogenen Reaktionen entwickeln. Führen Sie beispielsweise fluorescein-Angiographie (FA) oder Scanning-Laser-Konfokalmikroskopie19 durch, um die Vaskulatur zu visualisieren (Abbildung 4). Verwenden Sie die optische Kohärenztomographie (SD-OCT) der Spektraldomäne, um Netzhautschichten in vivo zu visualisieren (Abbildung 4).</li>
	<li>Auf Wunsch untersuchen Sie funktionelle Veränderungen in verschiedenen Netzhautzellpopulationen nach der INduktion durch DIE Verwendung der Elektroretinographie (ERG) (Abbildung 5).</li>
</ol>5. Gewebesammlung und Vorbereitung von Retinal-Flachhalterungen
HINWEIS: Sammeln Sie das Gewebe gemäß der gewünschten Forschungshypothese. Bei Mäusen die Proben z.B. bei P12 (zur Untersuchung der Vaso-Obliteration nach der hyperoxischen Phase) oder in der hypoxischen Periode (P13-P17) sammeln. Sammeln Sie die Maus-OIR-Samples bei P17, dem häufigsten Zeitpunkt für die Probenahme, um den Peak in NV-Menge zu erkennen. In Ratte OIR, sammeln Sie die Proben bei P18-P21, um die höchste Menge an NV zu beobachten (Abbildung 3).
<ol><li>Wiegen Sie die Tiere vor der Probenahme.</li>
	<li>Um die Netzhautvaskulatur zu kennzeichnen, können tief anästhesierte Tiere mit FITC-Dextran transkardial durchlässig werden. (Alternativ färben Sie die Retinal flach mit Isolectin später).</li>
	<li>Opfern Sie die Tiere entweder mit einer Überdosierung von Anästhesiemedikamenten (z. B. Mischung aus Ketamin und Medetomidin, 300 mg/kg und 4 mg/kg für Mäuse) oder CO2-Inhalation.</li>
	<li>Sammeln Sie die Augen der Tiere, indem Sie hinter dem Augapfel mit gekrümmten Zangen greifen, schneiden Sie das Gewebe um die Augen und heben Sie das Auge aus der Umlaufbahn.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Augäpfel in frisch gemachtem, gefiltertem 4% Paraformaldehyd (in phosphatgepufferter Saline, PBS) für 1-4 h. Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Augäpfel 3 x 10 min mit PBS. Sezieren Sie die Netzhaut sofort oder lagern Sie sie in PBS bei +4 °C. VORSICHT: Paraformaldehyd ist durch Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie damit arbeiten. HINWEIS: Nehmen Sie während der Probenahme oder einer Phase der Gewebeverarbeitung keinen Druck auf den Augapfel auf, um eine Netzhautablösung zu vermeiden, wenn Querschnitte von ganzen Augäpfeln durchgeführt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie retinale flache Halterungen vor, um die Menge an NV und die Größe von AVAs zu quantifizieren. Alternativ können Sie die Augäpfel/Retinas für die Histologie oder RNA- oder Proteinanalyse verarbeiten. Sezieren Sie die Netzhaut unter einem Stereomikroskop mit Mikroschere und Zange.<ol>
<li>Legen Sie den Augapfel in PBS, um ihn feucht zu halten und den Augapfel am Limbus mit einer Nadel (23G) zu durchstechen und mit einer gekrümmten Mikroschere um den Limbus zu schneiden, um Iris und die Hornhaut zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie die Spitze der Schere vorsichtig zwischen Sklera und Netzhaut und schneiden Sie Sklera in Richtung des Sehnervs. Tun Sie das gleiche auf der anderen Seite des Augapfels, und schneiden/reißen Sie die Sklera sorgfältig, bis der Netzhautbecher ausgesetzt ist. Ziehen Sie die Linse aus der Netzhautschale und fügen Sie PBS in die Tasse.</li>
		<li>Entfernen Sie alle Hyaloidgefäße, Glaskörper und Schmutz, ohne die Netzhaut zu beschädigen. Waschen Sie die Netzhaut, indem Sie PBS in die Netzhauttasse einfügen. Führen Sie vier Einschnitte (bei 12, 3, 6 und 9 Uhr) zur Netzhaut mit gerader Mikroschere aus, um eine blütenähnliche Struktur zu bilden. Optional können Sie die Schnitte mit chirurgischer Klinge vor der Montage der Proben vornehmen. Heben Sie die Netzhaut mit einem weichen Pinsel auf eine well-Platte für die Färbung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschriften Sie die Netzhautvaskulatur mit Isolectin B4, das die Oberfläche von Endothelzellen färbt (wenn die Tiere nicht mit FITC-Dextran durchdrungen waren). Inkubieren Sie die Netzhaut im Blockierpuffer (10% NGS + 0,5% Triton in TBS) für 1 h und waschen Sie mit 1% NGS + 0,1% Triton in TBS für 10 min. Inkubieren Sie die Netzhaut mit fluoreszierendem Farbstoff konjugiertes Isolectin B4 (5-10g/ml) in 1% NGS + 0,1% Triton in TBS über Nacht bei +4 °C, während sie vor dem Licht geschützt sind. HINWEIS: Beschriften Sie auf Wunsch andere Zellen wie Entzündungszellen und Pericyten mit spezifischen Antikörpern.</li>
	<li>Waschen Sie die Netzhaut 3x für 10 min mit 1% NGS + 0,1% Triton in TBS und heben Netzhaut auf einem mikroskopischen Schiebeschlitten, innere Netzhaut nach oben gerichtet. Verteilen Sie die Netzhaut vorsichtig mit weichem Pinsel und entfernen Sie alle verbleibenden Hyaloidgefäße oder Schmutz. Fügen Sie das Montagemedium zu einem Decksschlupf hinzu und legen Sie es auf die Netzhaut. Netzhaut bei +4 °C lagern und vor Licht schützen.</li>
</ol>6. Analyse der Flachhalterungen
<ol><li>Nehmen Sie Bilder der retinalen flachen Halterungen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 10-fachem Objektiv auf. Fokus simpere sich auf den oberflächlichen Gefäßplexus und die präretinale Neovaskularisation. Erstellen Sie ein Kachelscanbild, um die gesamte Netzhaut zu erfassen und die Kachelscans zusammenzuführen</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Bilder, indem Sie die AVAs, den NV-Bereich und den gesamten Netzhautbereich mit einem Bildverarbeitungsprogramm messen (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Zeichnen Sie die AVAs und den gesamten Netzhautbereich mit einem Freihand-Zeichnungswerkzeug und wählen Sie die neovaskulären Bereiche mit einem Auswahlwerkzeug aus. Die Software misst die Bereiche, die für Pixel von Interesse sind, und die AVA- und NV-Bereiche (ausgedrückt in Pixel) können verwendet werden, um ihren Prozentsatz im Verhältnis zur gesamten Netzhautfläche zu berechnen. Außerdem stehen einige Software-Tools zur Quantifizierung von NV zur Verfügung. HINWEIS: Kürzlich wurden ein Open-Source-Programm zur Quantifizierung von Schlüsselwerten von OIR-Bildern mit Deep Learning-Neuralnetzen eingeführt und bieten ein zuverlässiges Werkzeug für die reproduzierbare Quantifizierung von retinaler AVA und NV (z. B. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Sie Antikörper für den immunhistochemischen Nachweis einzelner Zellpopulationen verwenden, quantifizieren Sie die Anzahl der gefärbten Zellen (wie Mikroglia, Abbildung 2B) von den retinalen Flachhalterungen von Hand oder auf Wunsch durch automatisierte Bildanalysesysteme.</li>
</ol>7. Statistik
<ol><li>Analysieren Sie normal verteilte Daten nach Student es t Test oder One-Way ANOVA, je nach Dunnetts oder Tukeys Mehrfachvergleichstest. Verwenden Sie nichtparametrische Tests wie Mann-Whitney U-Test oder Kruskal Wallis-Test für nicht normal verteilte Daten. Berücksichtigen Sie die statistisch signifikanten Unterschiede auf der Ebene P < 0,05.</li>
</ol>

Die Autoren Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD, und Rubina Thapa sind Mitarbeiter der Experimentica Ltd.
Der Autor Giedrius Kalesnykas, PhD, ist Mitarbeiter (Präsident und Chief Executive Officer) und Aktionär der Experimentica Ltd., die Vertragsforschungsdienstleistungen mit präklinischen OIR-Modellen anbietet, die in diesem Artikel verwendet werden.
Tero Järvinen, M.D., PhD, und Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, haben nichts zu verraten.

Die Schwere des Krankheitsphänotyps hängt sowohl vom Stamm als auch vom Anbieter sowohl in den MOper- als auch in der Muhr der OIR-Modelle23ab. Dies deutet darauf hin, dass es eine breite genotypische Variabilität in der Pathologieentwicklung gibt. Im Allgemeinen entwickeln pigmentierte Nagetiere einen schwereren Phänotyp als die Albino-Nagetiere. Zum Beispiel, die netzhautvaskulatur von albino BALB/c revaskularisiert schnell nach Hyperoxien und entwickelt nV überhaupt nicht...

Zuverlässige und reproduzierbare experimentelle Modelle sind erforderlich, um die Pathologie hinter angiogenen Augenerkrankungen zu untersuchen und neue Therapeutika für diese verheerenden Krankheiten zu entwickeln. Die pathologische Angiogenese ist das Kennzeichen für die nasse altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und für viele ischämische Netzhauterkrankungen, darunter Retinopathie der Frühreife (ROP), proliferative diabetische Retinopathie (PDR) und Netzhautvenenverschluss (RVO)1,2,3,4. Menschliche und Nagetier Netzhaut folgen einem ähnlichen Muster der Entwicklung, da sowohl menschliche und Nagetier Netzhaut gehören zu den letzten Geweben, die vaskularisiert werden. Bevor sich die Netzhautvaskulatur vollständig entwickelt hat, erhält die Netzhaut ihre Nährstoffzufuhr aus der hyaloiden Vaskulatur, die wiederum nachlässt, wenn die Netzhautvaskulatur beginnt,1,2zu entwickeln. Bei der menschlichen, retinalen Gefäßentwicklung wird vor der Geburt abgeschlossen, während bei Nagetieren das Wachstum der netzretinalen Vaskulatur nach der Geburt auftritt. Da die retinale Gefäßentwicklung postnatal bei Nagetieren auftritt, bietet sie ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese2,3zu untersuchen. Die neugeborenen Nagetiere haben eine avaskuläre Netzhaut, die sich allmählich entwickelt, bis die vollständige vaskuläre Netzhautentwicklung bis zum Ende der dritten postnatalen Woche4erreicht ist. Die wachsenden Blutgefäße der neonatalen Maus sind plastisch, und sie durchlaufen Regression während Hyperoxia Stimulus5.
ROP ist die Hauptursache für Kinderblindheit in westlichen Ländern, da es fast 70% der Frühgeborenen mit Geburtsgewicht unter 1.250 g6,7betrifft. ROP tritt bei Frühgeborenen auf, die geboren werden, bevor Netzhautgefäße ihr normales Wachstum vollenden. ROP schreitet in zwei Phasen voran: In Phase I verzögert die Frühgeburt das retinale Gefäßwachstum, wobei nach Phase II die unvollendete Vaskularisation der sich entwickelnden Netzhaut Hypoxie verursacht, die die Expression angiogener Wachstumsfaktoren induziert, die das Wachstum neuer und abnormaler Blutgefäße stimulieren8. Das OIR-Modell ist ein weit verbreitetes Modell, um die Pathophysiologie von ROP und anderen ischämischen Retinopathien zu studieren sowie neuartige Wirkstoffkandidaten2,3,9zu testen. Es wird weithin als reproduzierbares Modell für die Durchführung von Proof-of-Concept-Studien für potenzielle antiangiogene Medikamente für Augen- und Nicht-Augenerkrankungen angesehen. Die beiden Nagetiermodelle, d.h. Maus und Ratte OIR unterscheiden sich in ihrem Modell Induktion und Krankheit Phänotyp. Das Rattenmodell imitiert den ROP-Phänotyp genauer, aber das Mausmodell bietet ein robusteres, schnelleres und reproduzierbareres Modell für die retinale Neovaskularisation (NV). Im Mausmodell entwickelt sich NV zur zentralen Netzhaut. Diese pathologische Auslesung ist wichtig in pharmakologischen Wirksamkeitsstudien für viele ischämische Retinopathien, wie PDR, RV und exsudative AMD sowie für nicht-okuläre, angiogene Erkrankungen wie Krebs. Darüber hinaus macht die Verfügbarkeit von genetisch manipulierten (transgenen und Knockout) Mäusen das Maus-OIR-Modell zu einer beliebteren Option. Allerdings erzeugt weder das OIR-Modell der Maus noch der Ratte eine Netzhautfibrose, die typisch für menschliche Krankheiten ist.
Das Verständnis, dass ein hoher Sauerstoffgehalt zur Entwicklung von ROP in den 1950er Jahren10,11 führte zur Entwicklung von Tiermodellen. Die ersten Studien über die Wirkung von Sauerstoff auf die Netzhautvaskulatur wurden 195012,13,14 durchgeführt und bis in die 1990er Jahre gab es viele Verfeinerungen des OIR-Modells. Die Forschung von Smith et al. im Jahr 1994 setzte einen Standard für das aktuelle Maus-OIR-Modell, das Hyaloidopathie von Retinopathietrennt 15. Eine breite Anwendung der Methode zur Quantifizierung von Vaso-Obliteration und pathologischer NV durch Connor et al. (2009) steigerte seine Popularitätweiter 16. In diesem Modell werden Mäuse bei 75% Sauerstoff (O2) für 5 Tage bei P7 platziert, gefolgt von 5 Tagen unter normoxischen Bedingungen. Hyperoxia von P7 bis P12 bewirkt, dass die Netzhautvaskulatur in der zentralen Netzhaut zurückgeht. Nach der Rückkehr zu normoxischen Bedingungen wird die avaskuläre Netzhaut hypoxisch (Abbildung 1A). Aufgrund der hypoxischen Reize der avaskulären zentralen Netzhaut sprießen einige der retinalen Blutgefäße in Richtung des Glaskörpers und bilden präretinale NV, sogenannte präretinale Büschel2,3. Diese Büschel sind unreif und hyperpermeable. Die NV-Spitzenmenge bei P17, danach geht sie zurück. Die Netzhaut ist vollständig reaskularisiert und NV wird vollständig durch P23 - P25 (Abbildung 2A)2,3zurückgedrängt.
Das OIR-Modell der Ratte (mit unterschiedlichenO2-Werten)wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben und zeigte, dass unterschiedlicheO2-Werte bei 80 % und 40 % eine ausgeprägtere NV verursachen als unter 80 %O2 konstante Exposition17. Später wurde entdeckt, dass das intermittierende Hypoxie-Modell, bei demO2 aus Hyperoxia (50%) Hypoxie (10-12 %), verursacht noch mehr NV als das 80/40% O2 Modell18. Im 50/10%-Modell sind Rattenwelpen 20 % lang 50 % ausgesetzt, gefolgt von 24 Stunden in 10 % O2. Diese Zyklen werden bis P14 fortgesetzt, wenn die Rattenwelpen an normoxische Bedingungen zurückgegeben werden (Abbildung 1B). Wie bei menschlichen ROP-Patienten entwickeln sich im Rattenmodell die avaskulären Bereiche aufgrund eines unreifen retinalen Gefäßplexus zur Peripherie der Netzhaut (Abbildung 3).
In beiden Modellen sind die Hauptparameter, die normalerweise quantifiziert werden, die Größe von AVA und NV. Diese Parameter werden in der Regel von retinalen flachen Halterungen analysiert, wo die Endothelzellen mit4,16beschriftet sind. Zuvor wurde die Menge an präretinalen NV aus Netzhautquerschnitten durch Zählen von Blutgefäß- oder Gefäßzellkernen, die sich über der inneren grenzenden Membran bis hin zu Glaskörpern ausdehnten, ausgewertet. Die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass es nicht möglich ist, die AVAs zu quantifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

Eines der am häufigsten verwendeten Modelle für ischämische Retinopathien ist das sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell (OIR). Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für die INduktion des OIR-Modells und deren Auslesungen bei Mäusen und Ratten. Die retinale Neovaskularisation wird in OIR induziert, indem Nagetierwelpen entweder Hyperoxia (Mäuse) oder abwechselnden Hyperoxia- und Hypoxie-Werten (Ratten) aussetzen. Die primären Auslesungen dieser Modelle sind die Größe der neovaskulären (NV) und avaskulären (AVA) Bereiche in der Netzhaut. Dieses präklinische In-vivo-Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller antiangiogener Medikamente zu bewerten oder um die Rolle bestimmter Gene in der retinalen Angiogenese durch den Einsatz genetisch manipulierter Tiere zu thematisieren. Das Modell weist eine gewisse Belastungs- und herstellerspezifische Variation in der OIR-Induktion auf, die bei der Gestaltung der Experimente berücksichtigt werden sollte.

Das Hauptergebnis des Modells ist der vaskuläre Phänotyp: die Größe der AVAs und die Menge an NV. Im Maus-OIR-Modell tritt die Vaso-Obliteration in der zentralen Netzhaut auf (Abbildung 2A), während sie sich im Rattenmodell in der Peripherie entwickelt, d.h. ähnlich wie der menschliche ROP22 (Abbildung 3A). Dies liegt daran, dass sich der oberflächliche Gefäßplexus bereits entwickelt hat, wenn Mäuse Hyperoxie ausgesetzt sind, w?...

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Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K Aufrufe.  Tampere University & Tampere University Hospital. Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Serie: Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

Gentransfer bei ischämischen Herzinsuffizienz in einem vorklinischen Modell

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Forschung

Medizin

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work well in non-ischemic wounds may not work in human diabetic wounds because vasculopathy is one major factor that hinders healing of these wounds. We published an article in 2007 describing a rabbit ear ischemic wound model created by a minimally invasive surgical technique. Since then, we have further simplified the procedure for easier operation. On one ear, three small skin incisions were made on the vascular pedicles, 1-2 cm from the ear base. The central artery was ligated and cut along with the nerve. The whole cranial bundle was cut and ligated, leaving only the caudal branch intact. A circumferential subcutaneous tunnel was made through the incisions, to cut subcutaneous tissues, muscles, nerves, and small vessels. The other ear was used as a non-ischemic control. Four wounds were made on the ventral side of each ear. This technique produces 4 ischemic wounds and 4 non-ischemic wounds in one animal for paired comparisons. After surgery, the ischemic ear was cool and cyanotic, and showed reduced movement and a lack of pulse in the ear artery. Skin temperature of the ischemic ear was 1-10 &deg;C lower than that on the normal ear and this difference was maintained for more than one month. Ear tissue high-energy phosphate contents were lower in the ischemic ear than the control ear. Wound healing times were longer in the ischemic ear than in the non-ischemic ear when the same treatment was used. The technique has now been used on more than 80 rabbits in which 23 were diabetic (diabetes time ranging from 2 weeks to 2 years). No single rabbit has developed any surgical complications such as bleeding, infection, or rupture in the skin incisions. The model has many advantages, such as little skin disruption, longer ischemic time, and higher success rate, when compared to many other models. It can be safely used in animals with reduced resistance, and can also be modified to meet different testing requirements.

We have developed a minimally invasive technique to create a rabbit ischemic ear wound model by dividing the central artery and nerve and the cranial neurovascular bundle. A subcutaneous tunnel then cuts all subcutaneous tissues. This procedure causes minimal skin disruption and can be safely used in diabetic animals.

Eine vereinfachte Methode zur Herstellung eines ischämischen Wundmodell

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. Sublethal ischemia has also been shown to upregulate protective mechanisms in remote tissues. A brief period of ischemia (5-10 min) in the hind limb of mammals induces self-protective responses in the brain, lung, heart and retina. The effect is known as remote ischemic preconditioning (RIP). It is a therapeutically promising way of protecting vital organs, and is already under clinical trials for heart and brain injuries. This publication demonstrates a controlled, minimally invasive method of making a limb &#8211; specifically the hind limb of a rat &#8211; ischemic. A blood pressure cuff developed for use in human neonates is connected to a manual sphygmomanometer and used to apply 160 mmHg pressure around the upper part of the hind limb. A probe designed to detect skin temperature is used to verify the ischemia, by recording the drop in skin temperature caused by pressure-induced occlusion of the leg arteries, and the rise in temperature which follows release of the cuff. This method of RIP affords protection to the rat retina against bright light-induced damage and degeneration.

Remote ischemic preconditioning (RIP) is a method of conditioning tissues against damaging stress. We have established a method of remote ischemia at the hind limb, by inflating a sphygmomanometer cuff for 5-10 min. The neuroprotective capabilities of RIP have been demonstrated in a model of retinal degeneration in rodents.

Remote Limb ischämischen Präkonditionierung: eine neuroprotektive Technique in Nagetiere

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. To investigate pathological mechanisms of retinal ischemia, relevant experimental models need to be developed. Anatomically, a main retinal blood supplying vessel is the ophthalmic artery (OpA) and OpA originates from the internal carotid artery of the common carotid artery (CCA). Thus, disruption of CCA could effectively cause retinal ischemia. Here, we established a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion (tBCCAO) to tie the right CCA with 6-0 silk sutures and to occlude the left CCA transiently for 2 seconds via a clamp, and showed that tBCCAO could induce acute retinal ischemia leading to retinal dysfunction. The current method reduces reliance on surgical instruments by only using surgical needles and a clamp, shortens occlusion time to minimize unexpected animal death, which is often seen in mouse models of middle cerebral artery occlusion, and maintains reproducibility of common retinal ischemic findings. The model can be utilized to investigate the pathophysiology of ischemic retinopathies in mice and further can be used for in vivo drug screening.

Here, we describe a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion using simple sutures and a clamp. This model can be useful for understanding the pathological mechanisms of retinal ischemia caused by cardiovascular abnormalities.

Ein murines Modell der ischämischen Netzhautverletzung induziert durch transiente bilaterale gemeinsame Carotis ArterieNverschluss

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...