マリアンヌ・カールスバーグ、アン・マリ・ハーパニエミ、パイヴィ・パルタネン、アン・カンクネンの技術サポートに感謝します。この研究は、フィンランドアカデミー、パイビキ、サカリ・ソールバーグ財団、タンペレ結核財団、フィンランド医学財団、ピルカンマー病院地区研究財団、タンペレ大学病院研究基金によって資金提供されました。

ここに記載されているプロトコルは、フィンランドの国家動物倫理委員会(プロトコル番号ESAVI/9520/2020およびESAVI/6421/04.10.07/2017)によって承認されています。
1. 実験動物とマウスOIRモデル誘導
注:例えば、一般的に使用されるC57BL / 6Jマウスを使用して、同じ日に生まれた子犬を得るために、時間交配動物を使用してください。育成ダム、例えば、129株(129S1 / SvImJまたは129S3 / SvIM)授乳ダムを使用して、ハイオキシアの誘導中および誘導後に子犬を看護します。あるいは、疲労のために授乳ダムを交換する必要がある場合に備えて、余分な授乳ダムがあることを確認してください。C57BL/6Jマウス/ダムを使用する場合、各ダムのごみサイズを6〜7匹に制限する(ごみがそれより大きい場合は、子犬が体重増加を制限する傾向がある場合)16。
<ol><li>過酸化誘発前後、および犠牲時の動物の体重を記録する。</li>
	<li>ケージの底に十分な食料があることを確認してください。</li>
	<li>濾過システムが使用されていないときに余分なCO2 を吸収するためにチャンバーの底部に色表示器とソーダライムを追加します。</li>
	<li>室内の湿度と温度を監視し、湿度を40~65%に保ちます。必要に応じて、チャンバーの底に水を入れる皿(例えば、ペトリ皿)を置くことによって、チャンバーの湿度を高めます。</li>
	<li>O2センサーを100%O2と通常の室内空気でキャリブレーションします。</li>
	<li>P7マウスをチャンバーに入れ、O2レベルを75%に設定します。マウスを5日間、P12までチャンバーに保管します。高酸素誘導時にチャンバーを開けないようにしてください。O2シリンダーのガス圧力を確認し、必要に応じてシリンダーを交換してください。誘導中に動物を監視します。</li>
	<li>チャンバーからマウスケージを取り出し、すべての子犬の重量を量ります。各実験群が子犬の体重分布が類似するように体重に基づいて子犬をグループ化する。</li>
</ol>2. 実験動物及びラットOIRモデル誘導(半閉系を用いた)
注:同じ日に生まれた子犬を取得するために、時間交配動物を使用してください。ラットOIRの場合は、ラットモデルで十分なNV誘導を得るために、約18の子犬/ダムの増加したごみサイズを使用してください。各ごみに十分な子犬を得るためにいくつかのごみから子犬をプールします。
<ol><li>誘導前後、および犠牲時の動物の体重を記録する。</li>
	<li>ケージの底に十分な食料があることを確認してください。</li>
	<li>濾過システムが使用されていない場合は、余分なCO2 を吸収するためにチャンバーの底部に色インジケーターとソーダライムを追加します。</li>
	<li>室内の湿度と温度を監視します。チャンバーの底にシリカゲルを加えて(複数のラットから生成される)余分な湿度を吸収します。</li>
	<li>O2センサーを100%N2と通常の室内空気でキャリブレーションします。</li>
	<li>ラットをP0(出産後数時間)のチャンバーに入れます。O2レベルを50%に設定し、O2シリンダをチャンバーに24時間接続します。その後、設定を10%O2に切り替え、窒素(N2)シリンダをチャンバーに24時間接続します。50%と10%のO2レベルの間で24時間のサイクリングを14日間続けます。</li>
	<li>研究中のガス消費量と動物の幸福を監視します。50/10%O2の間の変更の間にチャンバーを開き、必要に応じてより多くの食料と水を加えます。誘導時に動物のケージを清掃するように変更します。</li>
	<li>チャンバーからネズミのケージを取り出し、すべての子犬の重量を量ります。各実験群が子犬の体重分布が類似するように体重に基づいて子犬をグループ化する。</li>
</ol>3. 薬物投与(オプション)
注:OIRで一般的に使用される薬物投与経路は、マウスの場合はP12-P14、ラットの場合はP14で、ビトリアル治療(ivt)によるものである。実験の設定に基づいて、治療日を決定します。複数の子犬が実験に使用される場合は、すべてのごみから動物を持つために治療グループを分割します。好ましくは、片方の眼だけに薬物を注入し、対照として対側の目を保つ。
<ol><li>動物の重量を量り、尾や耳に識別マークを作ります。</li>
	<li>注射可能な麻酔(例えばケタミンとメデトミジンの混合物、マウスの場合は30mg/kgおよび0.4mg/kg)または吸入麻酔(2-3.5%のイゾフルランおよび200-350 mL/min気流)のいずれかで動物を麻酔する。つまんで麻酔の深さを確認します。治療中は、動物を加熱パッドの上に保管してください。</li>
	<li>局所麻酔の場合は、まぶたに鎮痛薬を一滴塗布します。マウスとラットがP14の周りに目を開くので、ivtを実行する前に鉗子で慎重にまぶたを開きます。鎮痛薬(例えば、オキシブプロカイン塩酸塩)を角膜に塗布します。</li>
	<li>ivt注射を行う前にヨウ素の滴を適用します。.</li>
	<li>ivt注射には、33-34G針が取り付けられたガラス注射器を使用してください。まぶたを押し下げ、眼球を鉗子で引っ張ります。注射を後肢に、およそ45° 角度針で視神経を向けて作る。</li>
	<li>1.0 μL以上をビトリア空間に注入しないようにしてください。注射液の還流を避けるために、薬剤を注入した後、30 sの針を所定の位置に保ちます.</li>
	<li>針を取り除いた後、眼(例えば、眼科鏡)で出血や眼の損傷などの合併症を調べます。注射後、角膜の上に抗生物質軟膏を塗布する。 注: マウスの ivt インジェクションボリュームは 0.5 ~ 1.0 μL にする必要があります。</li>
	<li>麻酔を逆にします(例えばメデトミジンのα2アンタゴニスト(2.5mg/kg)を使用して、子犬をケージに戻します。研究の終わりまでごみを通常の状態で収容する。</li>
</ol>4. インビボイメージングと電気レタイノグラフィー(オプション)
<ol><li>必要に応じて、血管新生応答の間にレティナで発症する変化を記録するために、フォローアップ期間中に生きている動物に生体イメージングを行う。例えば、蛍光血管造影(FA)または走査型レーザー共焦点顕微鏡19を行い、血管構造を可視化する(図4)。スペクトルドメイン光コヒレンス断層撮影(SD-OCT)を使用して、生体内のレチナル層を可視化する(図4)。</li>
	<li>必要に応じて、電解法(ERG)を用いてOIR誘導後の異なるレチン細胞集団の機能的変化を調査する(図5)。</li>
</ol>5. 組織の採取と、レチン状の平台の準備
注:所望の研究仮説に従って組織を収集します。マウスの場合、サンプルを例えばP12(高酸素相後の血管軟化を研究するため)または低酸素期(P13-P17)で採取する。P17でマウスOIRサンプルを収集し、これは、サンプリングのための最も一般的なタイムポイントであり、NV量のピークを検出します。ラットOIRでは、P18-P21でサンプルを収集して、NVの最高量を観察する(図3)。
<ol><li>サンプリング前に動物の重量を量る。</li>
	<li>残性血管系にラベルを付けるために、深く麻酔動物をFITC-dextranと経体的に浸透させることができる。(あるいは、後でイソレクチンでレティナルフラットマウントを染色する)。</li>
	<li>麻酔薬の過剰摂取(ケタミンとメデトミジンの混合物、マウスの場合は300mg /kgおよび4mg/kg)またはCO2 吸入のいずれかを使用して動物を犠牲にする。</li>
	<li>曲がった鉗子で眼球の後ろをつかんで動物の目を集め、眼の周りの組織を切り取り、軌道から目を持ち上げます。</li>
	<li>作りたてで眼球をインキュベートし、4%パラホルムアルデヒド(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)を1〜4時間濾過する。固定液を取り出し、眼球を3 x 10分PBSで洗います。すぐにレチナを解剖するか、+4°CでPBSに保管してください。 注意:パラホルムアルデヒドは、吸入、皮膚と接触し、飲み込んだ場合に有毒です。安全データシートを読んでから操作してください。 注:眼球全体の断面が行われている場合、網膜剥離を避けるために、サンプリング中または組織処理の任意の段階で眼球に圧力をかけないでください。</li>
	<li>NV の量と AVA のサイズを定量化するために、レティナル フラット マウントを準備します。あるいは、眼球/レチナを処理して、体質学、またはRNAまたはタンパク質分析を行います。マイクロハサミと鉗子を用いて、ステレオ顕微鏡でレチナを解剖する。<ol>
<li>眼球をPBSに入れ、針(23G)で手足の眼球を湿らせて穿刺し、湾曲したマイクロハサミで手足の周りを切って虹彩と角膜を取り除きます。</li>
		<li>慎重に、はさみの先端を、眼神経に向かって切り取り、皮切りと切り傷の間に置きます。眼球の反対側にも同じことを行い、レチンカップが露出するまで慎重に切り取り/引き裂きます。レティナルカップからレンズを引き出し、カップにPBSを加えます。</li>
		<li>すべてのヒアロイド血管、炎および破片を除去し、その後、残骸を傷つけることなく。レチンカップにPBSを加えて、レティナを洗います。まっすぐなマイクロハサミで、4つの切開(12、3、6、9時)を行い、花のような構造を作ります。必要に応じて、サンプルを取り付ける前に、外科用ブレードで切り傷を行います。柔らかいペイントブラシを使用してレティナをよくプレートに持ち上げて染色します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>内皮細胞の表面を染色するイソレクチンB4を使用して、レチナル血管系にラベルを付けます(動物にFITC-dextranを浸透させなかった場合)。1時間ブロッキングバッファー(10% NGS + 0.5% トリトン)でレティナをインキュベートし、1%NGS + 0.1% トリトンをTBSで10分間洗浄します。蛍光色素共役イソレクチンB4(5-10μg/ml)を1%NGS+0.1%トリトンで一晩+4°Cで光から保護しながら、レチナをインキュベートします。 注:必要に応じて、特定の抗体を使用して炎症細胞や潜血細胞などの他の細胞にラベルを付けます。</li>
	<li>TBSで1%NGS + 0.1%トリトンで10分間レチナ3倍を洗い、内側のレチナを上向きに向けた顕微鏡スライドでレチナを持ち上げます。柔らかい絵筆を使用して慎重にレティナを広げ、残りのヒアロイド容器や破片を取り除きます。取り付け用メディアをカバースリップに加え、遺素の上に置きます。レチナを+4 °Cで保存し、光から保護します。</li>
</ol>6. フラットマウントの解析
<ol><li>10xの目的を持つ蛍光顕微鏡を使用して、レティナルフラットマウントの画像を撮ります。表面血管叢および前脳血管新生に焦点を当てる。タイルスキャン画像を作成して、全体のretinaをキャプチャし、タイルスキャンをマージします</li>
	<li>画像処理プログラムを使用して、AVA、NVの面積、および全レティナル領域を測定して画像を定量化します( 資料表を参照)。<ol>
<li>自由な手描きツールを使用して、AVAと総レチナル領域を描画し、選択ツールを使用して新血管領域を選択します。ソフトウェアは、対象領域をピクセル単位で測定し、AVAとNV領域(ピクセル単位で表す)を使用して、総領域に対するパーセンテージを計算することができます。また、NV を定量化するためのソフトウェア ツールもいくつか用意されています。 注:最近、ディープラーニングニューラルネットワークを用いたOIR画像の主要値を定量化するためのオープンソースの完全自動化プログラムが導入され、RET-AVAとNV(例えば、https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21の再現可能な定量化のための信頼性の高いツールを提供しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>個々の細胞集団の免疫組織化学的検出に抗体を用いる場合、必要に応じて、必要に応じて、手で、または自動画像分析システムによって、染色された細胞(ミクログリア、 図2Bなど)を、レチナルフラットマウントから定量化します。</li>
</ol>7. 統計
<ol><li>必要に応じて、スチューデントのt検定またはワンウェイANOVAで正規分布データを分析し、その後にダネットまたはTukeyの複数比較テストを行います。マン・ホイットニーU検定や、非正規分布データのクルスカル・ウォリス検定などのノンパラメトリック検定を使用します。P < 0.05 レベルで統計的に有意な差を考慮してください。</li>
</ol>

著者マリア・ヴェハトゥパ、博士号、ニーナ・ヤスケカイネン、マルク・セラダ・ヒメネス、博士号、ルビーナ・タパは、株式会社実験の従業員です。
著者ギドリウス・カレスニカス博士は、この記事で使用される前臨床OIRモデルを採用した契約研究サービスを提供する従業員(社長兼最高経営責任者)および株式会社エクスペリシカの株主です。
テロ・ヤルヴィネン博士、博士号、ハネレ・ウシタロ=ヤルヴィネン博士は何も開示する必要はありません。

疾患表現型の重症度は、マウスおよびラットOIRモデル23の両方における株およびベンダーの両方に依存する。これは、病理の発達に広い遺伝子学的変動があることを示唆している。一般に、色素化したげっ歯類は、アルビノよりも重篤な表現型を発症する。例えば、アルビノBALB/cの血管系の筋血管は、高酸素症後に急速に血管化し、全24でNVを発症しない。?...

血管新生眼疾患の背後にある病理を研究し、これらの壊滅的な疾患に対する新しい治療法を開発するために、信頼性と再現性のある実験モデルが必要です。病理学的血管新生は、湿潤加齢黄斑変性症(AMD)の特徴であり、その中でも多くの虚血性網膜症の未熟児網膜症(ROP)、増殖性糖尿病網膜症(PDR)および網膜静脈閉塞(RVO)1、2、3、4の特徴である。ヒトとげっ歯類の両方が血管化された最後の組織の一つであるため、ヒトとげっ歯類のretinaは同様の発達パターンに従う。残管血管系が完全に発達する前に、レティナはヒアルイド血管系から栄養供給を受け取り、その結果、その後、残性血管系が発達し始めると後退する。ヒトでは、生前に血管の血管の発達が完了し、げっ歯類では出生後に血管系の成長が起こる。歯立ちの後に生後に起こる血管の発達は、血管形成2,3を研究する理想的なモデルシステムを提供する。新生児げっ歯類は、第3週目4の終わりまでに完全な血管内の残性が発達するまで徐々に発達する血管性の無脈を有する。新生児マウスの成長血管はプラスチックであり、彼らは過酸素刺激5の間に退行を受ける。
ROPは、1,250 g6,7の出生体重を有する未熟児のほぼ70%に影響を及ぼすので、西洋諸国における小児失明の主な原因である。ROPは、レチナル血管が正常な成長を完了する前に生まれた未熟児に発生する。第1期において、早産は、第II期の後に、発達中の性状性の残管化が低酸素症を引き起こし、新しい異常な血管成長を刺激する血管新生成長因子の発現を誘発する、再発性血管成長を遅らせる。OIRモデルは、ROPおよび他の虚血性網膜症の病態生理学を研究し、新しい薬剤候補2、3、9をテストするために広く使用されているモデルである。眼疾患および非眼疾患に対する潜在的な抗血管新生薬の概念実証研究を行うための再現性のあるモデルとして広く考えられています。2つのげっ歯類モデルすなわち、マウスとラットOIRは、そのモデル誘導および疾患表現型において異なる。ラットモデルはROP表現型をより正確に模倣しますが、マウスモデルは、より堅牢で迅速かつ再現性のあるモデルを提供し、より強く、より迅速に再現性の高いモデルを提供します。マウスモデルでは、NVは中央のレティナに発達する。この病理学的読み出しは、PDR、RVおよび滲出性AMDなどの多くの虚血性網膜症、ならびに癌のような非眼球、血管新生疾患に対する薬理学的有効性研究において重要である。さらに、遺伝的に操作された(トランスジェニックおよびノックアウト)マウスの利用可能性は、マウスOIRモデルをより一般的な選択肢にする。しかし、マウスもラットOIRモデルも、ヒト疾患に典型的な筋線維症を作り出さない。
高酸素濃度が1950年代10年のROPの発展に寄与するという理解は、動物モデルの開発につながった。酸素が残性血管系に及ぼす影響に関する最初の研究は1950年12年、13年、14年に行われ、1990年代までOIRモデルには多くの改良がありました。1994年のSmithらの研究は、ヒャロイドパシーと網膜症を分離する現在のマウスOIRモデルの標準を設定した。コナーら(2009)によって血管義務と病理学的NVを定量化する方法の広い採用は、その人気をさらに高めた16.このモデルでは、マウスはP7で5日間、75%酸素(O2)に配置され、続いてノルモキシ状態で5日間置かれる。P7からP12までの高酸素症は、心筋の後退に筋脈管を引き起こす。ノルモキシ性状態に戻ると、血管性の無酸素性の無酸素状態になる(図1A)。血管中央部の低酸素刺激により、いくつかの陰部血管が、膜前房2,3と呼ばれる前レチナルNVを形成し、膜前に向かって芽生える。これらの房は未熟で、過透過性です。NV の量は P17 でピークに達し、その後は後退します。レチナは完全に再血管化され、NVはP23 - P25(図2A)2、3によって完全に後退する。
ラットOIRモデル(O2の様々なレベルを用いた)は、80%および40%でO2レベルを変動させることが80%O2定常暴露17の下よりも顕著なNVを引き起こすことを示す1990年代に最初に説明された。その後、O2が過酸化症からサイクルされる断続的な低酸素モデル(50%)が発見された低酸素症(10-12%)に、80/40%O2モデル18よりもさらに多くのNVを引き起こす。50/10%モデルでは、ラットの子犬は24時間50%に曝され、次いで10%O2で24時間が続く。これらのサイクルは、ラットの子犬がノルモキシ状態に戻されるまでP14まで続く(図1B)。ヒトROP患者のように、ラットモデルでは、未熟な心血管叢のために、血管領域がレチナの周辺に発達する(図3)。
どちらのモデルでも、通常は定量化される主なパラメータは、AVAとNVのサイズです。これらのパラメータは通常、内皮細胞が4,16のラベルが付いているレチナルフラットマウントから分析されます。以前は、プレレチナルNVの量は、血管または血管細胞核を数えることによって、内膜の上の膜上の膜に延びることによって、レチナル断面から評価した。このアプローチの主な制限は、AVA を定量化できないことです。

<table><tbody><tr><td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05, 10mm, 25&amp;deg;, PS4</td><td>For intravitreal injection</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>For image analysis</td></tr><tr><td>Air pump air100</td><td>Eheim GmbH &amp;amp; Co. KG.</td><td>143207</td><td>For inhalation anaesthesia</td></tr><tr><td>Anaesthesia unit 410 AP</td><td>Univentor Ltd.</td><td>2360309</td><td>For inhalation anaesthesia</td></tr><tr><td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td><td>VWR International Ltd</td><td>22666.362</td><td>For CO2 control during model induction</td></tr><tr><td>Attane Vet 1000 mg/g</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 17 05 79</td><td>For inhalation anaesthesia</td></tr><tr><td>Brush</td><td></td><td></td><td>For preparation of flat mounts</td></tr><tr><td>Carbon dioxide gas</td><td></td><td></td><td>For sacrifice</td></tr><tr><td>Celeris D430 ERG system</td><td>Diagnosys LLC</td><td>121</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; ERG</td></tr><tr><td>Cell culture dishes</td><td>Greiner Bio-One International GmbH</td><td>664 160</td><td>For preparation of flat mounts</td></tr><tr><td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 08 78 96</td><td>For anaesthesia</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15165452</td><td>For preparation of flat mounts</td></tr><tr><td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td></tr><tr><td>E702 O2 sensor</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>E207, 1801901</td><td>For oxygen level measurement</td></tr><tr><td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td><td>Bioptigen, Inc.</td><td>BPN000668</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; imaging</td></tr><tr><td>Eye spears</td><td>Beaver-Visitec International, Inc.</td><td>0008685</td><td>For intravitreal injection and &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; imaging</td></tr><tr><td>Flexilux 600LL Cold light source</td><td>Mikron</td><td>11140</td><td>For intravitreal injection or tissue collection</td></tr><tr><td>Fluorescein sodium salt</td><td>Merck KGaA</td><td>F6377-100G</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; imaging</td></tr><tr><td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td><td>UNO Roestvaststaal BV</td><td>GEX 17015249</td><td>For inhalation anaesthesia</td></tr><tr><td>Glass syringe, Model 65 RN</td><td>Hamilton Company</td><td>7633-01</td><td>For intravitreal injection</td></tr><tr><td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td><td>Heidelberg Engineering GmbH</td><td>Spec-KT-05488</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; imaging</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>I21411</td><td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td></tr><tr><td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td><td>Intervet International B.V.</td><td>vnr 51 14 85</td><td>For anaesthesia</td></tr><tr><td>Medicinal Oxygen gas</td><td></td><td></td><td>For disease model induction</td></tr><tr><td>Mice C57BL/6JRj</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>Also other strains possible</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>For preparation of flat mounts</td></tr><tr><td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb U.K Limited</td><td>vnr 24 11 304</td><td>For intravitreal injection</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td></td><td></td><td>For disease model induction (rat)</td></tr><tr><td>Oftan Chlora 10 mg/g</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 01 11</td><td>For intravitreal injection</td></tr><tr><td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 43</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; ERG</td></tr><tr><td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 50</td><td>For intravitreal injection</td></tr><tr><td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 04 12 36</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; imaging</td></tr><tr><td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>803</td><td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td></tr><tr><td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>538</td><td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td></tr><tr><td>Rats CD(SD)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Also other strains possible</td></tr><tr><td>Revertor 5 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 13 04 97</td><td>For anaesthesia reversal</td></tr><tr><td>Silica gel</td><td></td><td></td><td>For humidity control during model induction</td></tr><tr><td>Systane Ultra 10ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2050250</td><td>For hydration of the eye</td></tr><tr><td>Systane Ultra unit 0.7ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2064871</td><td>For hydration of the eye</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1343-9108</td><td>For preparation of flat mounts</td></tr><tr><td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td><td>VWR</td><td>VL180S 170301</td><td>For drying silica gel</td></tr><tr><td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td><td>VWR</td><td>481067</td><td>For intravitreal injection or tissue collection</td></tr></tbody></table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

虚血性網膜症に一般的に使用されるモデルの1つは酸素誘発性網膜症(OIR)モデルです。ここでは、OIRモデル誘導の詳細なプロトコルと、マウスとラットの両方における読み出しについて説明します。OIRでは、高酸素(マウス)または高酸素および低酸素(ラット)の交互レベルのいずれかにげっ歯類の子犬を曝露することによって、OIRで新生血管新生が誘導される。これらのモデルの主要な読み出しは、新血管(NV)および無血管(AVA)領域の大きさです。この前臨床インビボモデルは、潜在的な抗血管新生薬の有効性を評価したり、遺伝子操作された動物を用いて、遺伝子新生における特定の遺伝子の役割に対処するために使用することができる。このモデルは、OIR誘導に歪みとベンダー固有の変動があり、実験を設計する際に考慮する必要があります。

モデルの主な結果は血管表現型:AAのサイズとNVの量です。マウスOIRモデルでは、血管軟化は中央のレチナ(図2A)で起こり、ラットモデルでは周囲に発症する、すなわちヒトROP22 と同様である(図3A)。これは、マウスが高酸素状態に曝露されると表面血管叢が既に発症しており、一方ラットモデルでは、OIR誘導時の無血管(P0)である。?...

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Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

酸素誘導網膜症(OIR)は、未熟児網膜症や糖尿病網膜症の増殖などの虚血性網膜症をモデル化し、新血管疾患の抗血管新生薬の評価における概念実証研究のモデルとして使用することができます。OIRは、定量化できるレチナにおける堅牢で再現性の新生血管化を誘導する。

げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

oxygen-induced-retinopathy-model-for-ischemic-retinal-diseases

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K ビュー.  Tampere University & Tampere University Hospital. 酸素誘導網膜症(OIR)は、未熟児網膜症や糖尿病網膜症の増殖などの虚血性網膜症をモデル化し、新血管疾患の抗血管新生薬の評価における概念実証研究のモデルとして使用することができます。OIRは、定量化できるレチナにおける堅牢で再現性の新生血管化を誘導する。

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Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

神経科学

Rat Model of Photochemically-Induced Posterior Ischemic Optic Neuropathy

Posterior Ischemic optic neuropathy (PION) is a sight-devastating disease in clinical practice. However, its pathogenesis and natural history have&#160;remained poorly understood. Recently, we developed a reliable, reproducible animal model of PION and tested the treatment effect of some neurotrophic factors in this model1. The purpose of this video is to demonstrate our photochemically induced model of posterior ischemic optic neuropathy, and to evaluate its effects with retrograde labeling of retinal ganglion cells. Following surgical exposure of the posterior optic nerve, a photosensitizing dye, erythrosin B, is intravenously injected and a laser beam is focused onto the optic nerve surface. Photochemical interaction of erythrosin B and the laser during irradiation damages the vascular endothelium, prompting microvascular occlusion mediated by platelet thrombosis and edematous compression. The resulting ischemic injury yields a gradual but pronounced retinal ganglion cell dieback, owing to a loss of axonal input - a remote, injury-induced and clinically relevant outcome. Thus, this model provides a novel platform to study the pathophysiologic course of PION,&#160;and can be further optimized for testing therapeutic approaches for optic neuropathies as well as other CNS ischemic diseases.

The goal of this protocol is to photochemically induce ischemic injury to the posterior optic nerve in rat. This model is critical to studies of the pathophysiology of posterior ischemic optic neuropathy, and therapeutic approaches for this and other optic neuropathies, as well as of other CNS ischemic diseases.

光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル

Posterior Ischemic optic neuropathy (PION) is a sight-devastating disease in clinical practice. However, its pathogenesis and natural history ...

医学

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

眼圧の上昇を通じて、網膜虚血再灌流障害のマウスモデル

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Nonarteritic前部虚血性視神経症の齧歯類モデル（rNAION）

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. To investigate pathological mechanisms of retinal ischemia, relevant experimental models need to be developed. Anatomically, a main retinal blood supplying vessel is the ophthalmic artery (OpA) and OpA originates from the internal carotid artery of the common carotid artery (CCA). Thus, disruption of CCA could effectively cause retinal ischemia. Here, we established a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion (tBCCAO) to tie the right CCA with 6-0 silk sutures and to occlude the left CCA transiently for 2 seconds via a clamp, and showed that tBCCAO could induce acute retinal ischemia leading to retinal dysfunction. The current method reduces reliance on surgical instruments by only using surgical needles and a clamp, shortens occlusion time to minimize unexpected animal death, which is often seen in mouse models of middle cerebral artery occlusion, and maintains reproducibility of common retinal ischemic findings. The model can be utilized to investigate the pathophysiology of ischemic retinopathies in mice and further can be used for in vivo drug screening.

Here, we describe a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion using simple sutures and a clamp. This model can be useful for understanding the pathological mechanisms of retinal ischemia caused by cardiovascular abnormalities.

一過性両側性頸動脈閉塞による虚血性筋炎損傷のマウスモデル

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), proliferative diabetic retinopathy (PDR), and retinal vein occlusion (RVO). Most OIR studies observe retinal neovascularization at specific time points; however, the dynamic vessel growth in live mice along a time course, which is essential for understanding the OIR-related vessel diseases, has been understudied. Here, we describe a step-by-step protocol for the induction of the OIR mouse model, highlighting the potential pitfalls, and providing an improved method to quickly quantify areas of vaso-obliteration (VO) and neovascularization (NV) using immunofluorescence staining. More importantly, we monitored vessel regrowth in live mice from P15 to P25 by performing fluorescein fundus angiography (FFA) in the OIR mouse model. The application of FFA to the OIR mouse model allows us to observe the remodeling process during vessel regrowth.

This protocol describes a detailed method for the preparation and immunofluorescence staining of mice retinal flat mounts and analysis. The use of fluorescein fundus angiography (FFA) for mice pups and image processing are described in detail as well.

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>網膜病理を研究するための網膜虚血-再灌流障害のマウスモデル

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, and other vaso-occlusive conditions. This manuscript presents a method for inducing ischemia-reperfusion injury in a mouse model. The method utilized anterior chamber cannulation attached to a saline reservoir, generating hydrostatic pressure to raise the intraocular pressure to 90-100 mmHg. This method effectively caused constriction of retinal capillaries to induce retinal ischemia. At the end of the ischemic period (60 min), the intraocular pressure was normalized (&#8804;20 mmHg) before removing the cannula from the anterior chamber to initiate reperfusion. Days after the ischemia/reperfusion procedure, the eyes were collected and sectioned for histological staining. The histopathology of the retinal sections was scored by evaluating eight parameters of retinal injury: folds, hemorrhage, deformation, cell loss in the ganglion cell, inner nuclear, outer nuclear, and photoreceptor layers, and damage to retinal pigment epithelial cells. This method provided a reproducible model to study the mechanisms and pathology of retinal ischemia/reperfusion injury. In addition, this model can facilitate the discovery of potential therapeutic targets to treat retinal ischemia/reperfusion injury, advancing the study of retinal pathologies and improving patient outcomes.

<meta charset="utf8"></head><body>マウス眼モデルにおける網膜虚血-再灌流障害の誘導

This protocol models retinal ischemia-reperfusion injury in a mouse eye by inducing retinal ischemia via anterior chamber cannulation and intraocular pressure elevation, followed by intraocular pressure normalization to initiate the reperfusion.

マウス眼モデルにおける網膜虚血-再灌流障害の誘導

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, ...

げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

要約

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マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル

眼圧の上昇を通じて、網膜虚血再灌流障害のマウスモデル

Nonarteritic前部虚血性視神経症の齧歯類モデル（rNAION）

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

一過性両側性頸動脈閉塞による虚血性筋炎損傷のマウスモデル

生体内再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

マウス眼モデルにおける網膜虚血-再灌流障害の誘導

げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

要約

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マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル

眼圧の上昇を通じて、網膜虚血再灌流障害のマウスモデル

Nonarteritic前部虚血性視神経症の齧歯類モデル（rNAION）

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

一過性両側性頸動脈閉塞による虚血性筋炎損傷のマウスモデル

生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

マウス眼モデルにおける網膜虚血-再灌流障害の誘導

生体内再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し