Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein JSPS KAKENHI-Stipendium der Japan Society for the Promotion of Science (Nr. 19K10397 an H.K. und Nr. 18K09862 an I.M.) unterstützt.

Alle Tierbehandlungen und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Tohoku-Universität durchgeführt.
1. Sektion der neugeborenen dmp1-Topas-Maus Calvaria
<ol><li>Verwenden Sie für dieses Protokoll 6 bis 7 Tage alte Welpen von C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-Mäusen. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran-Inhalation und setzen Sie die Welpen dann in 70% Ethanol um.</li>
	<li>Übertragen Sie den eingeschläferten Welpen in eine unbehandelte Kulturschale.</li>
	<li>Fassen Sie mit Schere und Pinzette die Haut an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt.</li>
	<li>Schneiden Sie mit dem ersten Schnitt als Ausgangspunkt auf beiden seitlichen Seiten des Schädels vor den Ohren, entfernen Sie die Haut und legen Sie die Schädeldecke frei.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf vom Nasenrücken und schneiden Sie die Schädeldecke entlang der Lambdoidnaht. Schneiden Sie entlang der seitlichen Ränder der Scheitelknochen und verlängern Sie sie bis zum vorderen Teil.</li>
	<li>Trennen Sie den Schädeldach vom darunter liegenden Hirngewebe. Anmerkungen: Um eine saubere knöcherne Schädeldecke mit minimalem Weichteilansatz zu gewährleisten, schneiden Sie nicht tief in den Knochen ein. Als Referenz sollte man in der Lage sein, den Schatten der Schere unter dem Knochen zu sehen.</li>
	<li>Übertragen Sie den Schädeldeckel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 während des gesamten Protokolls). Stellen Sie sicher, dass der konkave Teil nach oben zeigt.</li>
</ol>2. Fraktionierung der Schädeldecke von neugeborenen Mäusen
<ol><li>Übertragen Sie bis zu 5 Calvariae in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 ml 2 mg/ml Kollagenase-Lösung. Verwenden Sie frische Kollagenase-Lösung, die kurz vor der Anwendung zubereitet wird.<ol><li>Zur Herstellung einer frischen Kollagenaselösung wird Kollagenasepulver in den Isolationspuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM Sorbitol,3 mMK2HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5 mg/ml Glukose und 25 mM HEPES) mit2 mg/ml gegeben. Das Kollagenase-Pulver auf einem Magnetrührer auflösen.</li>
		<li>Lassen Sie die Kollagenaselösung durch eine 0,22 μm sterile Filtereinheit in ein 50-ml-Röhrchen laufen und bewahren Sie sie während des gesamten Protokolls auf Eis auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubieren Sie den Schädeldach bei 37 °C für 20 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min, um Fraktion 1 zu erhalten.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Aufschluss von Fraktion 1, waschen Sie die Schädeldecke mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entsorgen Sie die Wäsche.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Schädeldach in 5 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bei 37 °C für 15 min auf einem Schüttler bei 300 U/min.</li>
	<li>Sammeln Sie den Aufschluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Golgatha mit 5 ml PBS und fügen Sie die Waschlösung dem Aufschluss hinzu. Anmerkungen: Pipettieren Sie die Knochen an jedem Punkt des Sammelns und Waschens in ihrer Lösung, um die Zellen vom Knochen zu lösen und Dubletten und Zellaggregate zu verhindern.</li>
	<li>Um Fraktion 2 zu erhalten, wird der Aufschluss bei 300 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM), das 10 % fötales Kälberserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Auf einer 10 cm Kulturschale aussäen. Fraktion 2 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.</li>
	<li>Um Bruch 3 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.6. Fraktion 3 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren. HINWEIS: An diesem Punkt werden die Knochen kleiner und sie werden in Fragmente zerlegt. Um sicherzustellen, dass keine Knochen versehentlich in die Verdauungen abgesaugt werden, was zu Zellverlust führt, verwenden Sie eine kleine Spitzenpipette zum Auffangen der Verdauungen (1000\u2012200 μL Pipettenspitzen).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.</li>
	<li>Um Bruch 4 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 6. Fraktion 4 bei 37 °C unter 5% CO2 inkubieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Schädeldeckel in 5 ml 5 mM EDTA mit 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bei 37 °C für 15 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min.</li>
	<li>Um Bruch 5 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 20122.6. Fraktion 5 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren. Osteozyten können noch am selben Tag für die Sortierung vorbereitet oder bis zu 24 Stunden vor der Sortierung kultiviert werden.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Osteozyten für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium jeder Zellfraktion und waschen Sie es vorsichtig zweimal mit 10 ml PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml 0,5%iges Trypsin-EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C. Fügen Sie 5 ml 10% FBS α-MEM hinzu und pipettieren, um die Zellen sanft zu lösen. Kombinieren Sie die Zellen in jeder Fraktion, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und sammeln Sie sie, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie dem Pellet 10 % FBS α-MEM hinzu. Stellen Sie die Zellkonzentration auf ca. 1 x 107 Zellen/ml ein.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen in einem 35 μm dicken Röhrchen mit Nylonnetzverschluss. Die Zellen sind nun bereit für FACS.</li>
	<li>Verwenden Sie für dieses Protokoll eine Düse mit einer Größe von 100 μm. Die Sammelflüssigkeit sollte zu 10 % aus FBS α-MEM bestehen. Halten Sie die zu sortierende Probe unter Rühren und wenn möglich bei 4 °C.</li>
	<li>Optimieren Sie vor dem Sortieren das Gating, um Artefakte und Zellen zu entfernen, indem Sie den SSC-Bereich (Side Scatter) und den FSC-Bereich (Forward Scatter) anpassen. Eliminieren Sie Dubletten, indem Sie SSC-Breite vs. SSC-Höhe und FSC-Fläche vs. FSC-Breite anpassen. GFP-negative Osteozyten sollten als Kontrolle verwendet werden, um die Parameter des Sortierinstruments einzustellen.</li>
	<li>Nachdem die Zellentnahme abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.</li>
	<li>Suspendieren Sie die Zellen erneut und passen Sie die Anzahl mit 10 % FBS-α-MEM wie gewünscht an.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der erste isolierte Osteozyten stammte aus einer Huhn-Calvaria7 , die mit Hilfe von (OB7.3) oder der avianten Variante von PHEX isoliert wurde. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von praktikablen Antikörpern begrenzt, da Osteozyten-spezifische Antikörper hergestellt werden müssen, die auch speziesspezifisch sind. Die Forscher verwendeten eine andere Modifikation des sequenziellen enzymatischen Prozesses, um Osteozyten aus langen Knochen von Mäusen und Ratten zu gewinnen. Die ber...

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen aus osteoblastischen Vorläuferzellen, die in ihre sezernierte Matrix eingebettet wurden1. Sie sind die am häufigsten vorkommenden und langlebigsten Zellen unter den Knochenzellpopulationen. Sie befinden sich in Lakunen und haben eine charakteristische Sternmorphologie mit Dendriten, die sich durch Kanäle erstrecken, die als Canaliculi bezeichnet werden und ein ausgedehntes Netzwerk der Kommunikation und des Stoffwechselaustauschs mit ihrer Umgebung und der Knochenoberfläche bilden2. Osteozyten choreografieren sowohl die Rolle von Osteoblasten als auch von Osteoklasten beim Knochenumbau, sie sind die primären mechanosensorischen Zellen, die die Anpassung an mechanische Belastungen gewährleisten3, sind an der Phosphathomöostase4 und der Knochenmatrixmineralisierung5 beteiligt und fungieren zusammen mit dem lakunokanalikulären System als endokrines Organ, das entfernte Gewebe signalisiert6.
Osteozyten befinden sich in einer mineralisierten Matrix, was die Zugänglichkeit einschränkt und ihre Isolierung erschwert, was die In-vitro-Untersuchung erschwert. Eine der ersten Isolierungsmethoden beschrieb isolierte Osteozyten aus Hühnerschädeln unter Verwendung eines osteozytenspezifischen monoklonalen Antikörpers (OB7.3)7 , von dem später bekannt wurde, dass es sich um die aviäre Variante von PHEX (PHosphate-regulierendes Gen mit Homologie zu Endopeptidasen auf dem X-Chromosom) handelte8. Andere Forscher verwendeten die sequentielle Verdauung von langen Knochen von Ratte9 oder Maus 10, um osteozytenreiche Fraktionen zu erhalten, bei denen die Reinheit der Osteozyten bei etwa70 % lag9. Zu den Einschränkungen dieses Verfahrens gehört die suboptimale Reinheit von Kulturen, die neben Osteozyten auch mit anderen Zelltypen kontaminiert sind, und dass Osteozyten möglicherweise von anderen Zellen in Kultur überwachsen werden könnten, da Osteozyten die Fähigkeit zur Teilung verloren haben. Diese Herausforderungen schränken die Nutzbarkeit langfristiger Kulturen ein.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden verschiedene Osteozytenzelllinien entwickelt. Die MLO-Y4-Zelllinie11 und die MLO-A5-Zelllinie12 sind insbesondere die am weitesten untersuchten Zelllinien, die für die Untersuchung der Osteozyten im Frühstadium nützlich sind. Sie sind jedoch weniger nützlich für die Untersuchung der Signalübertragung reifer Osteozyten, da sie geringe Mengen an Sclerostin und FGF2313 exprimieren, die beide reife Osteozytenmarker sind. Andere Zelllinien, darunter IDG-SW3 14 und Ocy45415, exprimieren hohe Konzentrationen von Sclerostin und FGF23 und sind nützlich für die Untersuchung des späten Osteozytenstadiums. Zelllinien erweisen sich als nützliche Forschungswerkzeuge; Dennoch sind sie nicht ohne Einschränkungen, da sie die Biologie der Primärzelle nicht vollständig repräsentieren. Unterschiedliche Zelllinien repräsentieren unterschiedliche Entwicklungsstadien des Osteozytenreifespektrums, und Zelllinien repräsentieren nicht die Heterogenität der primären Osteozyten16,17.
Um Reinkulturen von primären Osteozyten zu erhalten, nutzten die Forscher das cre-Mausmodell, in dem der 8-kb-dmp1-Promotor verwendet wird, um die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Osteozyten zu steuern18,19. Zwei transgene Mäuse (pOB-Col 2.3-GFP-cyan und DMP1-GFP-topaz) von Paic et al.19 und dmp1-topaz-transgene Mäuse von Nakashima et al.20 wurden verwendet, um Osteozytenpopulationen zu erhalten. Dabei nutzten sie die sequentielle Verdauung und das FACS von Osteozyten, die GFP exprimieren, um Kulturen von primären Osteozyten zu erwerben19,20. Es konnte gezeigt werden, dass die Richtung von cre in der 10-kb dmp1-Reportermaus Ai9, die das tdTomato-Protein aktiviert, in Osteozyten, Osteoblasten, Muskeln und Zellen im Knochenmark vorhanden ist. Der 8-kb dmp1-Promotor hatte das gleiche Expressionsmuster, aber nur ein Teil der Osteoblasten und Knochenmarkzellen exprimierte das Protein, was darauf hindeutet, dass der 8-kb dmp1-Promotor spezifischer ist21. Trotzdem sollten Ergebnisse, die mit dem 8-kb-dmp1-Promotor erzielt wurden, mit Vorsicht interpretiert werden, und Genexpressionsprofile sollten routinemäßig unter Verwendung von Osteozyten- vs. Osteoblasten-spezifischen Markern erstellt werden, um sicherzustellen, dass die erhaltene Population von ausreichend hoher Reinheit ist.
Die Osteoklastenmarker OSCAR und Dcstamp wurden in hämatopoetischen nicht depletierten vs. depletierten Osteozytenpopulationen gefunden, was die Autoren zu der Schlussfolgerung führte, dass Verdauen, die durch Fraktionierung von 8-kb dmp1-topas neonatalen Calvaria und GFP-Sortierung erhalten wurden, mit hämatopoetischen Zellen kontaminiert sind. Die Kontamination mit hämatopoetischen Zellen hätte durch eine Straffung des GFP-Sortiertors gemildert werden können, da GFP-positive hämatopoetische Zellen eine relativ geringere GFP-Intensität aufwiesen als GFP-positive mesenchymale Zellen (Osteozyten)22.
Die Methoden zur Untersuchung von Osteozyten in vitro haben zu der jüngsten Fülle an Informationen über die Osteozytenbiologie beigetragen. Die Isolierung von Osteozyten ist jedoch nach wie vor ein arbeitsintensives und langwieriges Verfahren mit geringen Zellausbeuten. Die beschriebene Methode des Knochenaufschlusses unter Verwendung von Kollagenase und EDTA, oft bis zur Fraktion 823, dauert mehrere Stunden, in denen die Lebensfähigkeit der Osteozyten beansprucht wird. Forscher haben berichtet, dass Fraktionen (2\u20125) für die Zellsortierung 20 verwendet wurden, und haben gezeigt, dass das Expressionsprofil von Genen, die mit Osteozyten assoziiert sind, im Vergleich zu denen von Osteoblasten den Erfolg der Isolierung reiner Osteozytenpopulationen bestätigt20. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Gewinnung von Fraktionen (2\u20125) und vergleichen die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion, beginnend mit Fraktion 1 bis 8, um die Rückgabe von Osteozyten in jeder Fraktion zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Präparation von neugeborenen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Schädelstockverdauung mit Kollagenase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie die Vorbereitung von Zellen für FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Der Ostezyt, von dem man einst annahm, dass er ein passiver Bewohner des Knochens ist, da er hinter den Kulissen die Funktion hat, mechanische Belastungen zu erfassen, wird nun ins Rampenlicht gerückt und es hat sich gezeigt, dass er mehrere Hauptfunktionen hat, wie z. B. die aktive Modifikation der extrazellulären Matrix und die Bildung eines endokrinen Organs mit dem lakunokanalikulären System, das es umschließt, das Nachrichten an entfernte Orte sendet. Dank der Methoden, die es ermöglichten, den Osteozyten in vitro zu testen, von der Isolierung primärer Osteozyten bis hin zu osteozytenähnlichen Zelllinien, erfahren Osteozyten heute ein durchschlagendes Interesse und einen Wissensschub über Struktur und Funktion. Viele Aspekte der Osteozytenbiologie und der Wechselwirkung mit anderen molekularen Komponenten sind noch nicht entdeckt. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die effiziente Isolierung von primären Osteozyten aus dmp1-topas-neonatalen Mausschäumen, die das grün fluoreszierende Protein in Osteozyten exprimieren, durch Zellfraktionierung und anschließenden Erwerb von Kulturen primärer Osteozyten mittels FACS.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, den Prozess der Gewinnung von Kulturen primärer Osteozyten aus dmp1-topaz neonatalen Mausschädeln durch einen Fraktionierungsprozess unter Verwendung von Kollagenase zum Abbau der Kollagenmatrix und EDTA für die Calciumchelation zu demonstrieren, wonach die Zellen für FACS vorbereitet werden, um Osteozyten von anderen Zellpopulationen zu trennen.
Methoden zur Gewinnung primärer Osteozyten aus neonatalen Mausschäumen beschreiben häufig die Verwe...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

JoVE Journal

Biology

2.0K Aufrufe.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Serie: Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Forschung

Biologie

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...